王培智，李曉娟

(1.河南中醫(yī)學(xué)院科技處，河南 鄭州450008;2.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450008)

人CRIPTO-1 基因最初在人畸胎癌cDNA 的文庫(kù)中鑒定出來(lái)，因此也被稱為畸胎癌來(lái)源的生長(zhǎng)因子-1，定位于染色體3p21.3［1］。已有研究［2］表明，CRIPTO-1 在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。作者采用免疫組化和原位雜交(in situ hybridization，ISH)方法檢測(cè)CRIPTO-1 在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 90 例宮頸鱗癌、30 例宮頸上皮內(nèi)瘤變、30 例正常宮頸黏膜組織均來(lái)自于2008年5月至2013年8月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院及第二附屬醫(yī)院病理科存檔蠟塊?；颊咝g(shù)前均未服用任何抗腫瘤藥物，均未接受放、化療。90 例宮頸鱗癌患者年齡為28～77 歲，平均(55.8 ±15.3)歲，其中＜50 歲38 例，≥50 歲52 例。依據(jù)WHO(1985)腫瘤細(xì)胞分化程度標(biāo)準(zhǔn)，其中高分化22 例，中分化43 例，低分化25 例。依據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(2000)修訂的TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，其中I～Ⅱ期58 例，Ⅲ～Ⅳ期32 例。依據(jù)淋巴結(jié)情況，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59 例。經(jīng)40 g·L-1多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4 ～6 μm，用于HE、免疫組化及ISH 染色。

1.2 主要試劑及探針合成 CRIPTO-1 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，S-P 免疫組化試劑盒、DAB 顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SABio-AP、預(yù)雜交液、BCIP/NBT 均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。探針序列:原位雜交5’端生物素標(biāo)記、全硫代修飾探針均由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。CRIPTO-1 探 針 序 列:5’-TCACAGCCGGGTAGAAATGCCTGAGGAAAGCAGCGGA-3’。

1.3 免疫組化 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)采用免疫組化S-P法進(jìn)行CRIPTO-1 蛋白檢測(cè)。以美國(guó)Novus Biologicals公司提供的切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 ISH 方法 組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后，用新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)0.5% H2O2室溫處理約30 min;用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% 檸檬酸新鮮配制蛋白酶(0.01 g·L-1)，消化組織標(biāo)本中DNA 結(jié)合蛋白，37 ℃條件下10 min;每張玻片滴加25 μL 不含探針的預(yù)雜交液，42 ℃條件下預(yù)雜交4 h;加含探針(1 ng·L-1)的雜交液，42 ℃濕盒內(nèi)雜交12 h;0.1 ×標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽42 ℃條件下沖洗后，加SA-Bio-AP 37 ℃條件下10 min;漂洗后加BCIP/NBT，避光顯色2～4 h。并以不含探針的標(biāo)本作陰性對(duì)照。

1.5 結(jié)果判定［3］CRIPTO-1 蛋白和mRNA 陽(yáng)性信號(hào)分別為黃色及紫藍(lán)色顆粒樣物質(zhì)，均位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)不少于200 個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定［8］，采用9 分評(píng)分制。按照陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比:陽(yáng)性細(xì)胞＜10%為1 分，10% ～50%為2分，＞50%為3 分;按染色程度強(qiáng)弱:陰性為0 分，淡黃(藍(lán))色染色為1 分，中度黃(藍(lán))色染色為2 分，棕黃(紫藍(lán))色染色＜為3 分。然后將2 項(xiàng)評(píng)分的乘積作為總分，＜3 分為陰性，≥3 分為陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，陽(yáng)性率等比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman 相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CRIPTO-1 蛋白表達(dá)情況 CRIPTO-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)呈不同程度的黃色顆粒樣物質(zhì)，主要位于鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖1)。CRIPTO-1 蛋白在宮頸鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(65.6%)高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織(60.0%)及正常宮頸黏膜組織(10. 0%)(χ2=28.571，P ＜0.001)。CRIPTO-1 蛋白過(guò)表達(dá)與癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期均關(guān)系密切(χ2分別為10.676、9.718 及11.227;P 均＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 CRIPTO-1 mRNA 表達(dá)情況 CRIPTO-1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)呈不同程度藍(lán)紫色顆粒樣物質(zhì)，主要位于鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖1)。CRIPTO-1 mRNA 在宮頸鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(45.6%)高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織(23.3%)及正常宮頸黏膜組織(10.0%)(χ2=14.577，P=0.001)。CRIPTO-1 mRNA 過(guò)表達(dá)與癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期均關(guān)系密切(χ2分別為13.741、4. 720 及30. 170;P 均＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 宮頸鱗癌組織中CRIPTO-1 蛋白(A;S-P，×400)及mRNA(B;ISH，×400)的表達(dá)

表1 CRIPTO-1 蛋白和mRNA 表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 CRIPTO-1 蛋白及mRNA 在宮頸鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 在宮頸鱗癌組織中，CRIPTO-1 蛋白和mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r =0. 287，P ＜0. 05)。見(jiàn)表2。

表2 CRIPTO-1 蛋白及mRNA 表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

CRIPTO-1 具有癌基因的特性，其在胚胎發(fā)育和細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中牽涉到許多不同的信號(hào)途徑［4］，包括Nodal/ALK4/Smad-2 和Glypican-1/c-Src/MAPK/AKT信號(hào)途徑，并且CRIPTO-1 持續(xù)的過(guò)表達(dá)在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮極其重要的作用［5］。許多研究［6-7］報(bào)道CRIPTO-1 在正常黏膜和癌前病變組織中表達(dá)不同。此外，CRIPTO-1 的表達(dá)在癌前病變組織中顯著增加，如結(jié)腸腺瘤、胃黏膜的腸上皮生化和乳腺原位導(dǎo)管癌，并且CRIPTO-1 在結(jié)腸腺瘤組織中的表達(dá)水平是直接與不典型增生的程度、大小和組織學(xué)亞型有關(guān)的［8］。CRIPTO-1 的表達(dá)在高發(fā)生率的結(jié)腸癌家族的正常結(jié)腸黏膜標(biāo)本中有62%可被檢測(cè)到，但低風(fēng)險(xiǎn)患者的標(biāo)本中僅20%結(jié)腸腺瘤檢出CRIPTO-1 的陽(yáng)性表達(dá)［9］。

本文結(jié)果顯示，CRIPTO-1 在宮頸鱗癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá)則均存在一定程度的升高，且CRIPTO-1 蛋白及mRNA 過(guò)表達(dá)與宮頸鱗癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關(guān)，這就提示CRIPTO-1蛋白及mRNA 的過(guò)表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及進(jìn)展過(guò)程有密切的關(guān)系。此外，宮頸鱗癌組織中CRIPTO-1 蛋白的表達(dá)與CRIPTO-1 mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者表達(dá)具有一致性，聯(lián)合檢測(cè)有助于正確評(píng)估患者的病情進(jìn)展，給臨床治療方案的制定提供一定的參考依據(jù)。

［1］Cohen DJ，Ajani J.An expert opinion on esophageal cancer therapy［J］.Expert Opin Pharmacother，2011，12(2):225 -239.

［2］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69 -90.

［3］高冬玲，李晟磊，趙志華，等.食管鱗癌組織中RECK 和MMP-9基因mRNA 檢測(cè)與分析［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2008，35(13):748-751.

［4］Bianco C，Normanno N，Salomon DS，et al. Role of the cripto(EGF-CFC)family in embryogenesis and cancer［J］.Growth Factors，2004，22(3):133 -139.

［5］Strizzi L，Bianco C，Normanno N，et al.CRIPTO-1:a multifunctional modulator during embryogenesis and oncogenesis［J］. Oncogene，2005，24(37):5731 -5741.

［6］Zhang JG，Zhao J，Xin Y. Significance and relationship between CRIPTO-1 and p-STAT3 expression in gastric cancer and precancerous lesions［J］.World J Gastroenterol，2010，16(5):571 -577.

［7］Panico L，D'Antonio A，Salvatore G，et al.Differential immunohistochemical detection of transforming growth factor alpha，amphiregulin and CRIPTO in human normal and malignant breast tissues［J］.Int J Cancer，1996，65(1):51 -56.

［8］Saeki T，Salomon D，Gullick W，et al. Expression of CRIPTO-1 in human colorectal adenomas and carcinomas is related to the degree of dysplasia［J］.Int J Oncol，1994，5(3):445 -451.

［9］Saeki T，Salomon D，Normanno N，et al. Immunohistochemical detection of CRIPTO-1，amphiregulin and transforming growth-factoralpha in human gastric carcinomas and intestinal metaplasias［J］.Int J Oncol，1994，5(2):215 -223.