亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        豬繁殖與呼吸綜合征病毒新疆株的分離與鑒定

        2014-12-09 22:37:56張美玲簡子健陸桂麗等
        天津農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年11期
        關(guān)鍵詞:分離鑒定

        張美玲 簡子健 陸桂麗等

        摘 要:為了解豬繁殖與呼吸道綜合征在新疆的流行現(xiàn)狀,以及病毒毒株的分子生物學(xué)特征,對疑似該病病料進(jìn)行地方毒株的分離,并對其進(jìn)行鑒定。采集新疆烏魯木齊市七道灣某豬場疑似PRRS病死的豬只肺臟及淋巴結(jié)等組織病料,將其處理后接種到Marc-145細(xì)胞上,并盲傳3代;對分離株進(jìn)行毒力測定(TCID50),應(yīng)用RT-PCR方法對出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行分子檢測。結(jié)果顯示,分離到的新疆病毒株可發(fā)生細(xì)胞病變,在Marc-145細(xì)胞上的TCID50為10-5·mL-1。RT-PCR檢測結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因序列,將測序結(jié)果與GenBank已發(fā)表的PRRSV毒株基因序列進(jìn)行對比分析。研究證明所分離到的病毒為PRRSV,命名為XJ-Q。

        關(guān)鍵詞:豬繁殖與呼吸綜合征病毒;分離;鑒定

        中圖分類號:S852.651 文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A DOI 編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.008

        豬繁殖與呼吸道綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗稱藍(lán)耳病,是豬群發(fā)生以繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)癥狀為特征的一種急性、高度傳染的病毒性傳染病。其臨床特征是仔豬出現(xiàn)不同程度的呼吸道病癥及待產(chǎn)母豬的繁殖障礙,如木乃伊胎、弱仔、死胎或流產(chǎn),死亡率高[1]。該病于20世紀(jì)80年代末、90年代初在美國報(bào)道,而后迅速傳遍世界各個(gè)養(yǎng)豬國家,在豬群密集、流動頻繁的地區(qū)更易流行,常造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2],嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)安全。1987年P(guān)RRS首先發(fā)現(xiàn)于美國,1991年,Wensvoort等首次利用豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)從中分離出了PRRS病原(Lelystad)[2]。中國于1996年由郭寶清等[3-6]首次從流產(chǎn)胎兒中分離到豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV),從而證實(shí)我國也存在豬繁殖與呼吸綜合征,之后迅速蔓延至全國各地區(qū)[7-8]。為了解該病在新疆的流行現(xiàn)狀,及PRRSV抗體依賴性和高變異性增強(qiáng)等特點(diǎn),進(jìn)一步豐富 PRRSV毒株基因組的信息數(shù)據(jù),筆者對采自新疆烏魯木齊七道灣地區(qū)的病料組織處理后經(jīng)Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物進(jìn)行毒力測定、RT-PCR鑒定及測序鑒定,得到新疆地方毒株,為進(jìn)一步了解該病的流行現(xiàn)狀及其生物學(xué)特性提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材 料

        1.1.1 病料采集 在新疆烏魯木齊市某養(yǎng)豬場無菌采集疑似豬藍(lán)耳病死豬的肺臟、淋巴結(jié)等組織病料,-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.1.2 細(xì)胞及血清 Marc-145細(xì)胞系,由畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所傳染病實(shí)驗(yàn)室提供;胎牛血清(FBS)為生工生物產(chǎn)品。

        1.1.3 主要試劑及試劑盒 胰蛋白酶和青鏈霉素實(shí)驗(yàn)室保存,DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑為生工生物產(chǎn)品;TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)、DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司。

        1.2 方 法

        1.2.1 病料處理 青鏈霉素清洗病料數(shù)次,剪碎、研磨,加入適量的DMEM培養(yǎng)液將其稀釋至1∶3,反復(fù)凍融3次,分裝至1.5 mL無菌離心管中,3 000 r·min-1離心10 min后留上清液,0.22 μm過濾膜除菌,保留濾液為待分離病毒液,保存在-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇Marc-145細(xì)胞:從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管,瞬時(shí)放于37 ℃水浴恒溫鍋內(nèi),同時(shí)用鑷子輕輕搖晃凍存管2 min將管內(nèi)物質(zhì)完全融化后,在生物安全柜內(nèi)用移液器取出Marc-145細(xì)胞移入離心管中,加入無FBS DMEM至4.5 mL,1 000 r·min-1離心5 min。倒掉上清液,補(bǔ)加細(xì)胞生長液至7 mL,用吸管慢慢吹打混勻,移入培養(yǎng)瓶中,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否吹打散開,放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中,左右搖晃,擰上培養(yǎng)瓶瓶蓋(不可擰緊,稍有空隙,保證CO2能進(jìn)入瓶內(nèi))。隔夜后,棄去舊培養(yǎng)液,用無FBS DMEM培養(yǎng)液洗1次瓶內(nèi)細(xì)胞,再加入7 mL生長液(含10%胎牛血清FBS),酒精棉球擦拭瓶蓋及培養(yǎng)瓶上半身,放入培養(yǎng)箱內(nèi),如此傳至第3代進(jìn)行病毒分離。

        1.2.3 病毒分離 將1.2.1處理后的病料上清液經(jīng)0.22 μm過濾除菌,取1 mL過濾菌液接種于單層的Marc-145細(xì)胞,37 ℃溫箱中吸附60~90 min,期間每30 min搖晃1次,使病毒液均勻接觸細(xì)胞層,而后加入維持液(含2%胎牛血清)至7 mL,放于5% CO2 37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~5 d。盲傳3代,觀察細(xì)胞病變(CPE)。

        1.2.4 病毒的電鏡觀察 取致細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物,反復(fù)凍融3次,1 000 r·min-1離心15 min,濃縮后加0.8%甲醛滅活,2%磷鎢酸負(fù)染,透射電鏡觀察。

        1.2.5 病毒TCID50滴定 將長成單層的Marc-145細(xì)胞消化后移入96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔細(xì)胞單層生長大約80%密度,用于接種病毒,步驟如下。

        待測病毒液稀釋:將病毒液置于滅菌后的EP管中,采用維持液培養(yǎng)基進(jìn)行10倍遞增稀釋,取10-3~10-7稀釋度,每個(gè)稀釋度5個(gè)孔,每孔加入病毒液100 μL,同時(shí)設(shè)置2列對照孔(用維持液代替病毒液)。置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h,之后棄去病毒液,用無血清的DMEM洗滌后,加入100 μL維持液培養(yǎng)48 h后逐日觀察,直至第5天記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù),計(jì)算CPE比率。

        按Reed-Muench兩式法計(jì)算TCID50。

        1.2.6 病毒RNA的提取及RT-PCR 病毒RNA的提取:取750 μL病毒液,按照生工生物公司Trizol劑盒的操作步驟提取病毒總RNA。

        RT-PCR反應(yīng)。按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)試劑盒,利用自行設(shè)計(jì)的特異性引物,在PCR反應(yīng)管中加以下溶液及試劑:RNA模板0.5 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,2.5 mmol·(LdNTPs 2.5 μL)-1,引物(上、下游引物)1 μL,MgCl2 5 μL,RNase Inhibitor(4 μ·μL-1) 0.5 μL,AMVRTase 0.5 μL,AMV-Optimized Tap 0.5 μL,用無RNA酶水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性溫度50 ℃,時(shí)間30 min;預(yù)變性94 ℃,時(shí)間2 min;變性溫度94 ℃,時(shí)間30 s;退火溫度56 ℃,時(shí)間30 s;延伸溫度72 ℃,時(shí)間1 min,循環(huán)次數(shù)30;延伸溫度72 ℃,時(shí)間10 min。

        電泳:取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用0.8%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg·mL-1EB)電泳,100 V電壓40 min進(jìn)行電泳檢測。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 病毒分離結(jié)果

        2.2 病毒的電鏡觀察

        2.3 PRRSV分離株TCID50測定結(jié)果

        統(tǒng)計(jì)接種病毒的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,在5 d后出現(xiàn)CPE的情況,并用Reed-Muench法計(jì)算距離比得出TCID50結(jié)果為10-5·(100μL-1),即PRRSV分離株在Marc-145細(xì)胞上的增殖毒價(jià)為TCID50105·mL-1。

        2.4 RT-PCR鑒定結(jié)果

        瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,利用RT-PCR方法擴(kuò)增出大小與預(yù)計(jì)結(jié)果一致的片段434 bp(圖3)。將測得的序列與Gen Bank 數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對及相似性分析,結(jié)果表明,此分離病毒為PRRSV。

        3 結(jié)論與討論

        細(xì)胞分離、鑒定時(shí)PRRSV是最常用、也是最準(zhǔn)確的診斷方法之一。PRRSV分離主要使用低成本的傳代細(xì)胞如Marc-145細(xì)胞、豬肺泡巨噬細(xì)胞PAM[2]、CL2621細(xì)胞[9]。根據(jù)PRRSV分離株不同細(xì)胞嗜性也不同[10-11]。PRRSV更偏愛在PAM上復(fù)制,且親嗜性最高,但是PAM制備技術(shù)難度較大,CL2621細(xì)胞是專利細(xì)胞。目前對PRRSV既敏感又方便的細(xì)胞為Marc-145和從Marc-145中克隆出的HS2H細(xì)胞。有實(shí)驗(yàn)證明,PRRSV新疆分離株適宜在Marc-145細(xì)胞上生長[12],并從中分離到病毒,故本研究采用Marc-145細(xì)胞進(jìn)行PRRSV的分離培養(yǎng),同時(shí)也證實(shí)了新疆地區(qū)分離株在Marc-145細(xì)胞上培養(yǎng)有很好的增殖并能產(chǎn)生典型的CPE。

        對PRRSV的檢測方法很多,包括血清中和試驗(yàn)(SN)、核酸探針雜交技術(shù)、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)(IFA)、過氧化酶單層試驗(yàn)(IPMA)、膠體金抗體檢測技術(shù)(GIA)、乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)、RT-PCR及重組蛋白分子診斷技術(shù)[13-14]等。實(shí)驗(yàn)室檢測方法有:病毒的分離(VI),間接免疫熒光(IFA),血清中和試驗(yàn)(SVN),ELISA,RT-PCR等。豬繁殖與呼吸綜合征的檢測方法眾多,各有優(yōu)點(diǎn),其中病毒的分離、免疫熒光抗體染色法和免疫過氧化物酶染色法等均需細(xì)胞培養(yǎng)才行,因工作量大、周期長,故不利于在基層推廣應(yīng)用。而過氧化物酶單層試驗(yàn)需要大量豬肺泡巨噬細(xì)胞,同間接免疫熒光試驗(yàn)一樣,在檢測時(shí)會因?yàn)椴僮骰疃径a(chǎn)生實(shí)驗(yàn)室安全隱患,并且過氧化物酶單層試驗(yàn)與間接免疫熒光試驗(yàn)不適合大范圍檢測,RT-PCR方法則相對快速、簡便、特異性強(qiáng)。ELISA和IFA在眾多檢測PRRSV的方法中,步驟較為繁瑣,不適合快速診斷,而RT-PCR可快速鑒別診斷PRRSV,故本試驗(yàn)采用RT-PCR方法進(jìn)行分離病毒的檢測。

        本研究分離國內(nèi)新疆毒株,選用Marc-145細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng),連續(xù)傳代,盲傳3代即產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。根據(jù)分離病毒毒株致Marc-145的CPE、毒價(jià)滴定、RT-PCR反應(yīng)以及與GenBank上登陸的基因序列對比,證實(shí)所分離的病毒為PRRSV,與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[15],成功地從組織病料中分離得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),將其命名為PRRSV新疆株(XJ-Q)。細(xì)胞出現(xiàn)CPE后取其感染物,從中提取RNA并通過PCR法鑒定,結(jié)果與預(yù)期相符,從而實(shí)現(xiàn)了對所獲得分離培養(yǎng)物進(jìn)行快速、確切的鑒定。成功分離獲得的新疆分離株將為新疆PRRSV基因遺傳變異分析的研究奠定基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn):

        [1] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所.動物傳染病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2008:346-351.

        [2] Wensvoort G, Terpstra C, Pol J M, et al. Mystery swine disease in The Netherlands: The isolation of Lelystad virus[J].Vet Q,1991,13:121-130.

        [3] Stevenson G W,Van Alstine W G,Kanitz C I,et al. Endemic porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection of nursery pigs in two swine herds without current reproductive failure[J]. J Vet Diagn Invest,1993,5(3):432-434.

        [4] Shimizu M, Yamada S, Murakami Y, et al. Isolation of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome(PRRS) VirusfromeHeko-Heko disease of pigs[J].J Ver Med Sci,1994,56(2):

        389-391.

        [5] 郭寶清,陳章水,劉文興,等.從疑似PRRSV流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病,1996,87(2):1-4.

        [6] Mengeling W L, Larger K M, Vorwald A C, et al. Clinical effect s of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on pigs during the early postnatal interval[J].Am J Vet Res,1998,59:53-55.

        [7] 張婉華,葉向陽,祁賢,等.豬繁殖呼吸綜合征病毒(PRRSV)SA毒株的分離與鑒定[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2002,18(2):16-79.

        [8] 宋凌云,文英會,崔保安,等.豬繁殖與呼吸綜合征在我國的流行動態(tài)[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2005(2):43-45.

        [9] Bautisa E M, Goyal S M, Yoon I J, et al. Comparison of porcine alveolar macrophages and CL2621 for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and anti-PRRS antibody.[J].Vet Diagn Invest,1993(5):163-165.

        [10] 劉伍海,汪銘書,程安春,等.PRRSV感染Marc-145細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008(3):61-63.

        [11] Hanada K, Suzuki Y, Nakanc T. The origin and evolution of porcine reproductive and respiratorysyndrome viruses[J].Mol Biol and Evolut, 2005(22):1024-1031.

        [12] 馬偉,冉多良,黃瓊,等,豬繁殖與呼吸征病毒新疆株的分離鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(1):81-84.

        [13] 婁高明,杜偉賢,謝明權(quán),等.豬繁殖與呼吸道綜合癥病毒RT-PCR診斷方法建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2002,20(2):141-144.

        [14] 孫見,冷雪,譚斌,武華,等,豬繁殖與呼吸綜合征血清學(xué)檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012(6):24-27.

        [15] 朱佳毅.豬繁殖與呼吸綜合征病毒四種檢測方法的比較[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

        389-391.

        [5] 郭寶清,陳章水,劉文興,等.從疑似PRRSV流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病,1996,87(2):1-4.

        [6] Mengeling W L, Larger K M, Vorwald A C, et al. Clinical effect s of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on pigs during the early postnatal interval[J].Am J Vet Res,1998,59:53-55.

        [7] 張婉華,葉向陽,祁賢,等.豬繁殖呼吸綜合征病毒(PRRSV)SA毒株的分離與鑒定[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2002,18(2):16-79.

        [8] 宋凌云,文英會,崔保安,等.豬繁殖與呼吸綜合征在我國的流行動態(tài)[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2005(2):43-45.

        [9] Bautisa E M, Goyal S M, Yoon I J, et al. Comparison of porcine alveolar macrophages and CL2621 for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and anti-PRRS antibody.[J].Vet Diagn Invest,1993(5):163-165.

        [10] 劉伍海,汪銘書,程安春,等.PRRSV感染Marc-145細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008(3):61-63.

        [11] Hanada K, Suzuki Y, Nakanc T. The origin and evolution of porcine reproductive and respiratorysyndrome viruses[J].Mol Biol and Evolut, 2005(22):1024-1031.

        [12] 馬偉,冉多良,黃瓊,等,豬繁殖與呼吸征病毒新疆株的分離鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(1):81-84.

        [13] 婁高明,杜偉賢,謝明權(quán),等.豬繁殖與呼吸道綜合癥病毒RT-PCR診斷方法建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2002,20(2):141-144.

        [14] 孫見,冷雪,譚斌,武華,等,豬繁殖與呼吸綜合征血清學(xué)檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012(6):24-27.

        [15] 朱佳毅.豬繁殖與呼吸綜合征病毒四種檢測方法的比較[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

        389-391.

        [5] 郭寶清,陳章水,劉文興,等.從疑似PRRSV流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病,1996,87(2):1-4.

        [6] Mengeling W L, Larger K M, Vorwald A C, et al. Clinical effect s of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on pigs during the early postnatal interval[J].Am J Vet Res,1998,59:53-55.

        [7] 張婉華,葉向陽,祁賢,等.豬繁殖呼吸綜合征病毒(PRRSV)SA毒株的分離與鑒定[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2002,18(2):16-79.

        [8] 宋凌云,文英會,崔保安,等.豬繁殖與呼吸綜合征在我國的流行動態(tài)[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2005(2):43-45.

        [9] Bautisa E M, Goyal S M, Yoon I J, et al. Comparison of porcine alveolar macrophages and CL2621 for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and anti-PRRS antibody.[J].Vet Diagn Invest,1993(5):163-165.

        [10] 劉伍海,汪銘書,程安春,等.PRRSV感染Marc-145細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008(3):61-63.

        [11] Hanada K, Suzuki Y, Nakanc T. The origin and evolution of porcine reproductive and respiratorysyndrome viruses[J].Mol Biol and Evolut, 2005(22):1024-1031.

        [12] 馬偉,冉多良,黃瓊,等,豬繁殖與呼吸征病毒新疆株的分離鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(1):81-84.

        [13] 婁高明,杜偉賢,謝明權(quán),等.豬繁殖與呼吸道綜合癥病毒RT-PCR診斷方法建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2002,20(2):141-144.

        [14] 孫見,冷雪,譚斌,武華,等,豬繁殖與呼吸綜合征血清學(xué)檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012(6):24-27.

        [15] 朱佳毅.豬繁殖與呼吸綜合征病毒四種檢測方法的比較[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

        猜你喜歡
        分離鑒定
        刑事庭審中心主義視域下的“分離觀”
        試析檔案整理與鑒定
        中國油畫本土化的發(fā)展情況芻議
        古籍版本鑒定
        淺議檢察機(jī)關(guān)司法會計(jì)鑒定的主要職責(zé)
        青銅器鑒定與修復(fù)初探
        資治文摘(2016年7期)2016-11-23 00:23:20
        轉(zhuǎn)型背景下的民辦高校管理理念創(chuàng)新
        八種氟喹諾酮類藥物人工抗原的合成及鑒定
        融合與分離:作為一種再現(xiàn)的巫術(shù)、文字與影像世界的構(gòu)成
        高效液相色譜技術(shù)在石油化工中的應(yīng)用分析
        天堂√在线中文官网在线| 少妇我被躁爽到高潮在线影片 | 免费国产h视频在线观看86| 在线观看免费视频发布白白色| 亚洲精品中文字幕免费专区| 中文字幕人妻被公上司喝醉| 亚洲丁香婷婷综合久久小说| 久久国产精品一区二区| 在线观看亚洲av每日更新影片| 日韩aⅴ人妻无码一区二区| 人人妻人人澡人人爽精品欧美| 太大太粗太爽免费视频| 美艳善良的丝袜高跟美腿| 成人免费xxxxx在线观看| 亚洲精品成人专区在线观看| 成人国产自拍在线播放| 国产一品二品精品在线| 在线 | 一区二区三区四区| 国产欧美精品一区二区三区–老狼 | 欧美性xxxx狂欢老少配| 深夜福利国产| 婷婷丁香开心五月综合| 夜夜揉揉日日人人青青| 亚洲天堂在线播放| 狼人av在线免费观看| 日韩中文字幕有码午夜美女| 国产精品对白刺激久久久| 亚洲视频高清| 中文字幕日本av网站| 人妻饥渴偷公乱中文字幕| 亚洲精品你懂的在线观看| 黑人一区二区三区啪啪网站| 国产一区高清在线观看| 18禁裸男晨勃露j毛免费观看 | 青青草免费在线手机视频| 一二三四区中文字幕在线| 东北寡妇特级毛片免费| 久久99精品波多结衣一区| 亚洲av高清一区二区三区| 精品三级av无码一区| 日韩欧美国产丝袜视频|