張美玲　簡子健　陸桂麗等

摘 要：為了解豬繁殖與呼吸道綜合征在新疆的流行現(xiàn)狀，以及病毒毒株的分子生物學(xué)特征，對疑似該病病料進(jìn)行地方毒株的分離，并對其進(jìn)行鑒定。采集新疆烏魯木齊市七道灣某豬場疑似PRRS病死的豬只肺臟及淋巴結(jié)等組織病料，將其處理后接種到Marc-145細(xì)胞上，并盲傳3代；對分離株進(jìn)行毒力測定（TCID50），應(yīng)用RT-PCR方法對出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行分子檢測。結(jié)果顯示，分離到的新疆病毒株可發(fā)生細(xì)胞病變，在Marc-145細(xì)胞上的TCID50為10-5·mL-1。RT-PCR檢測結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因序列，將測序結(jié)果與GenBank已發(fā)表的PRRSV毒株基因序列進(jìn)行對比分析。研究證明所分離到的病毒為PRRSV，命名為XJ-Q。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；分離；鑒定

中圖分類號：S852.651 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.008

豬繁殖與呼吸道綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗稱藍(lán)耳病，是豬群發(fā)生以繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)癥狀為特征的一種急性、高度傳染的病毒性傳染病。其臨床特征是仔豬出現(xiàn)不同程度的呼吸道病癥及待產(chǎn)母豬的繁殖障礙，如木乃伊胎、弱仔、死胎或流產(chǎn)，死亡率高[1]。該病于20世紀(jì)80年代末、90年代初在美國報(bào)道，而后迅速傳遍世界各個(gè)養(yǎng)豬國家，在豬群密集、流動(dòng)頻繁的地區(qū)更易流行，常造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2]，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)安全。1987年P(guān)RRS首先發(fā)現(xiàn)于美國，1991年，Wensvoort等首次利用豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）從中分離出了PRRS病原（Lelystad）[2]。中國于1996年由郭寶清等[3-6]首次從流產(chǎn)胎兒中分離到豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV），從而證實(shí)我國也存在豬繁殖與呼吸綜合征，之后迅速蔓延至全國各地區(qū)[7-8]。為了解該病在新疆的流行現(xiàn)狀，及PRRSV抗體依賴性和高變異性增強(qiáng)等特點(diǎn)，進(jìn)一步豐富 PRRSV毒株基因組的信息數(shù)據(jù)，筆者對采自新疆烏魯木齊七道灣地區(qū)的病料組織處理后經(jīng)Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物進(jìn)行毒力測定、RT-PCR鑒定及測序鑒定，得到新疆地方毒株，為進(jìn)一步了解該病的流行現(xiàn)狀及其生物學(xué)特性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 病料采集 在新疆烏魯木齊市某養(yǎng)豬場無菌采集疑似豬藍(lán)耳病死豬的肺臟、淋巴結(jié)等組織病料，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 細(xì)胞及血清 Marc-145細(xì)胞系，由畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所傳染病實(shí)驗(yàn)室提供；胎牛血清（FBS）為生工生物產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑及試劑盒 胰蛋白酶和青鏈霉素實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑為生工生物產(chǎn)品；TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）、DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司。

1.2 方 法

1.2.1 病料處理 青鏈霉素清洗病料數(shù)次，剪碎、研磨，加入適量的DMEM培養(yǎng)液將其稀釋至1∶3，反復(fù)凍融3次，分裝至1.5 mL無菌離心管中，3 000 r·min-1離心10 min后留上清液，0.22 μm過濾膜除菌，保留濾液為待分離病毒液，保存在-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇Marc-145細(xì)胞：從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，瞬時(shí)放于37 ℃水浴恒溫鍋內(nèi)，同時(shí)用鑷子輕輕搖晃凍存管2 min將管內(nèi)物質(zhì)完全融化后，在生物安全柜內(nèi)用移液器取出Marc-145細(xì)胞移入離心管中，加入無FBS DMEM至4.5 mL，1 000 r·min-1離心5 min。倒掉上清液，補(bǔ)加細(xì)胞生長液至7 mL，用吸管慢慢吹打混勻，移入培養(yǎng)瓶中，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否吹打散開，放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中，左右搖晃，擰上培養(yǎng)瓶瓶蓋（不可擰緊，稍有空隙，保證CO2能進(jìn)入瓶內(nèi)）。隔夜后，棄去舊培養(yǎng)液，用無FBS DMEM培養(yǎng)液洗1次瓶內(nèi)細(xì)胞，再加入7 mL生長液（含10%胎牛血清FBS），酒精棉球擦拭瓶蓋及培養(yǎng)瓶上半身，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，如此傳至第3代進(jìn)行病毒分離。

1.2.3 病毒分離 將1.2.1處理后的病料上清液經(jīng)0.22 μm過濾除菌，取1 mL過濾菌液接種于單層的Marc-145細(xì)胞，37 ℃溫箱中吸附60～90 min，期間每30 min搖晃1次，使病毒液均勻接觸細(xì)胞層，而后加入維持液（含2%胎牛血清）至7 mL，放于5% CO2 37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。盲傳3代，觀察細(xì)胞病變（CPE）。

1.2.4 病毒的電鏡觀察 取致細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，1 000 r·min-1離心15 min，濃縮后加0.8%甲醛滅活，2%磷鎢酸負(fù)染，透射電鏡觀察。

1.2.5 病毒TCID50滴定 將長成單層的Marc-145細(xì)胞消化后移入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔細(xì)胞單層生長大約80%密度，用于接種病毒，步驟如下。

待測病毒液稀釋：將病毒液置于滅菌后的EP管中，采用維持液培養(yǎng)基進(jìn)行10倍遞增稀釋，取10-3～10-7稀釋度，每個(gè)稀釋度5個(gè)孔，每孔加入病毒液100 μL，同時(shí)設(shè)置2列對照孔（用維持液代替病毒液）。置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，之后棄去病毒液，用無血清的DMEM洗滌后，加入100 μL維持液培養(yǎng)48 h后逐日觀察，直至第5天記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，計(jì)算CPE比率。

按Reed-Muench兩式法計(jì)算TCID50。

1.2.6 病毒RNA的提取及RT-PCR 病毒RNA的提?。喝?50 μL病毒液，按照生工生物公司Trizol劑盒的操作步驟提取病毒總RNA。

RT-PCR反應(yīng)。按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）試劑盒，利用自行設(shè)計(jì)的特異性引物，在PCR反應(yīng)管中加以下溶液及試劑：RNA模板0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·（LdNTPs 2.5 μL）-1，引物（上、下游引物）1 μL，MgCl2 5 μL，RNase Inhibitor（4 μ·μL-1） 0.5 μL，AMVRTase 0.5 μL，AMV-Optimized Tap 0.5 μL，用無RNA酶水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度50 ℃，時(shí)間30 min；預(yù)變性94 ℃，時(shí)間2 min；變性溫度94 ℃，時(shí)間30 s；退火溫度56 ℃，時(shí)間30 s；延伸溫度72 ℃，時(shí)間1 min，循環(huán)次數(shù)30；延伸溫度72 ℃，時(shí)間10 min。

電泳：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用0.8%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg·mL-1EB）電泳，100 V電壓40 min進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

2.2 病毒的電鏡觀察

2.3 PRRSV分離株TCID50測定結(jié)果

統(tǒng)計(jì)接種病毒的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在5 d后出現(xiàn)CPE的情況，并用Reed-Muench法計(jì)算距離比得出TCID50結(jié)果為10-5·（100μL-1），即PRRSV分離株在Marc-145細(xì)胞上的增殖毒價(jià)為TCID50105·mL-1。

2.4 RT-PCR鑒定結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，利用RT-PCR方法擴(kuò)增出大小與預(yù)計(jì)結(jié)果一致的片段434 bp（圖3）。將測得的序列與Gen Bank 數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對及相似性分析，結(jié)果表明，此分離病毒為PRRSV。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞分離、鑒定時(shí)PRRSV是最常用、也是最準(zhǔn)確的診斷方法之一。PRRSV分離主要使用低成本的傳代細(xì)胞如Marc-145細(xì)胞、豬肺泡巨噬細(xì)胞PAM[2]、CL2621細(xì)胞[9]。根據(jù)PRRSV分離株不同細(xì)胞嗜性也不同[10-11]。PRRSV更偏愛在PAM上復(fù)制，且親嗜性最高，但是PAM制備技術(shù)難度較大，CL2621細(xì)胞是專利細(xì)胞。目前對PRRSV既敏感又方便的細(xì)胞為Marc-145和從Marc-145中克隆出的HS2H細(xì)胞。有實(shí)驗(yàn)證明，PRRSV新疆分離株適宜在Marc-145細(xì)胞上生長[12]，并從中分離到病毒，故本研究采用Marc-145細(xì)胞進(jìn)行PRRSV的分離培養(yǎng)，同時(shí)也證實(shí)了新疆地區(qū)分離株在Marc-145細(xì)胞上培養(yǎng)有很好的增殖并能產(chǎn)生典型的CPE。

對PRRSV的檢測方法很多，包括血清中和試驗(yàn)（SN）、核酸探針雜交技術(shù)、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFA）、過氧化酶單層試驗(yàn)（IPMA）、膠體金抗體檢測技術(shù)（GIA）、乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）、RT-PCR及重組蛋白分子診斷技術(shù)[13-14]等。實(shí)驗(yàn)室檢測方法有：病毒的分離（VI），間接免疫熒光（IFA），血清中和試驗(yàn)（SVN），ELISA，RT-PCR等。豬繁殖與呼吸綜合征的檢測方法眾多，各有優(yōu)點(diǎn)，其中病毒的分離、免疫熒光抗體染色法和免疫過氧化物酶染色法等均需細(xì)胞培養(yǎng)才行，因工作量大、周期長，故不利于在基層推廣應(yīng)用。而過氧化物酶單層試驗(yàn)需要大量豬肺泡巨噬細(xì)胞，同間接免疫熒光試驗(yàn)一樣，在檢測時(shí)會(huì)因?yàn)椴僮骰疃径a(chǎn)生實(shí)驗(yàn)室安全隱患，并且過氧化物酶單層試驗(yàn)與間接免疫熒光試驗(yàn)不適合大范圍檢測，RT-PCR方法則相對快速、簡便、特異性強(qiáng)。ELISA和IFA在眾多檢測PRRSV的方法中，步驟較為繁瑣，不適合快速診斷，而RT-PCR可快速鑒別診斷PRRSV，故本試驗(yàn)采用RT-PCR方法進(jìn)行分離病毒的檢測。

本研究分離國內(nèi)新疆毒株，選用Marc-145細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，連續(xù)傳代，盲傳3代即產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。根據(jù)分離病毒毒株致Marc-145的CPE、毒價(jià)滴定、RT-PCR反應(yīng)以及與GenBank上登陸的基因序列對比，證實(shí)所分離的病毒為PRRSV，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，成功地從組織病料中分離得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），將其命名為PRRSV新疆株（XJ-Q）。細(xì)胞出現(xiàn)CPE后取其感染物，從中提取RNA并通過PCR法鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符，從而實(shí)現(xiàn)了對所獲得分離培養(yǎng)物進(jìn)行快速、確切的鑒定。成功分離獲得的新疆分離株將為新疆PRRSV基因遺傳變異分析的研究奠定基礎(chǔ)。

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