王路喬，黃 波，黃茶花，王 伶，程曉曙*

自噬(autophagy)是將細胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及受損細胞器運輸?shù)饺苊阁w進行消化降解的過程，是一種廣泛存在的正常生理過程和防御機制。體內(nèi)外實驗均證實心肌缺血缺氧都能誘發(fā)細胞自噬發(fā)揮心肌保護作用［1－2］。然而，缺氧過程誘發(fā)自噬增強是否能通過下調(diào)促凋亡蛋白Bim和caspase-3表達，抑制凋亡從而發(fā)揮心肌保護作用呢?目前這一機制還不十分明確。另外，近年來研究證實缺氧或缺血過程中自噬的誘導激活涉及到低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的調(diào)控［3］，那么缺氧過程自噬的心肌保護作用是否與HIF-1的調(diào)控有關(guān)呢?

1 材料與方法

1.1 SD大鼠乳鼠心肌細胞分離與培養(yǎng)

新生1～3 d Spradgue-Dawley乳鼠(南昌大學動物科學實驗部)，75%乙醇浸泡數(shù)秒后，取出心臟剝除心外膜及多余組織，剪成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm大小的組織塊，0.08%胰蛋白酶和10%膠原酶37℃ CO2培養(yǎng)箱中消化2 h，離心重懸細胞，200目濾網(wǎng)過濾后差速貼壁2 h，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中。24 h后第1次換液，一般培養(yǎng)至第4天時進行實驗，實驗前給細胞換液。

1.2 缺氧模型建立及分組

將原代培養(yǎng)的心肌細胞置于缺氧盒中通入含95%N2，5%CO2的混合氣體30 min驅(qū)除缺氧小盒中的空氣后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中，分別缺氧0、2、4、8、14和24 h，取LC3-Ⅱ/Ⅰ(自噬標志物)表達顯著增高時間點的細胞，缺氧前1 h加入終濃度為10 mmol/L的3MA預處理心肌細胞抑制自噬過程，即缺氧+3MA(anoxia+3MA)組，同時設(shè)立對照組(control)和單純?nèi)毖踅M(anoxia)。

1.3 藥物及試劑

3-甲基腺嘌呤(3MA)(Sigma公司)。兔來源Bim(Cell singaling公司)，caspase-3(Santa Cruz公司)，HIF-1(Proteintech 公司)，兔抗鼠的 β-actin，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(中杉金橋生物公司)，化學發(fā)光劑(Thermo Scientific公司)。

1.4 細胞搏動頻率、異常節(jié)律和乳酸脫氫酶LDH活性的檢測

倒置顯微鏡下連續(xù)觀察60 s，評測各組心肌細胞搏動頻率和節(jié)律的變化。取各組中培養(yǎng)液500μL，南昌大學第二附屬醫(yī)院檢驗科測定乳酸脫氫酶LDH活性。

1.5 Western blot蛋白印跡

收集各組心肌細胞，總蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白。13%凝膠SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入5%牛血清白蛋白稀釋的兔抗Bim多克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，caspase-3多克隆抗體(1∶1 000)，HIF-1 多克隆抗體(1∶800)，再加入辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔IgG(1∶5 000)雜交1 h。ECL顯色液顯色，膠片曝光，ImageTool分析軟件對目的條帶進行灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各缺氧時間點心肌細胞自噬程度的變化

LC3-Ⅱ/Ⅰ反映自噬程度［2］。缺氧 8 h 后LC3-Ⅱ/Ⅰ較對照組顯著升高(p＜0.05)，缺氧24 h后 LC3-Ⅱ/Ⅰ最大 (圖1，表1)。

2.2 抑制自噬后心肌細胞搏動頻率、異常節(jié)律和LDH活性的變化

正常心肌細胞搏動頻率相近，節(jié)律規(guī)整;缺氧8 h后細胞搏動頻率下降，幅度減弱，異常搏動增加。抑制自噬后細胞搏動頻率顯著降低，異常搏動增加，極不規(guī)律，且LDH活性明顯增加(p＜0.05)(表2)。

圖1 缺氧模型中不同時間點心肌細胞自噬程度的變化Fig 1 Changes of degree of autophagy in anoxia model in cardiac myocytes for different times

表1 缺氧模型中不同時間點LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的吸光度值Table 1 The average optical density(A)value in anoxia model in cardiac myocytes for different times，n=3)

表1 缺氧模型中不同時間點LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的吸光度值Table 1 The average optical density(A)value in anoxia model in cardiac myocytes for different times，n=3)

＊P ＜ 0.05 compared with control．

anoxia 2 hours 4 hours 8 hours 14 hours 24 hours LC3-ⅠAOD value control 10±0.5 8±0.3 9±0.1 3±0.1 1±0.1 1±0.1 LC3-Ⅱ 25±1 24±1 24±1 23±1* 10±1* 18±1*

表2 各組心肌細胞搏動頻率和異常節(jié)律的變化Table 2 The changes of beating rate and arrhythmin cardiac myocytes，n=3)

表2 各組心肌細胞搏動頻率和異常節(jié)律的變化Table 2 The changes of beating rate and arrhythmin cardiac myocytes，n=3)

*P ＜0.05 compared with control;#p＜0.05 compared with anoxia．

group beating rate(times/min)arrhythm of cells(times/min)LDH(U/L)control 185±5 7±2 81±12 anoxia 103±7* 18±3* 146±20*anoxia+3MA 45±6# 50±6# 210±29#

2.3 Western blot檢測各組中 LC3-Ⅱ/Ⅰ、Bim、caspase-3和HIF-1的表達情況

缺氧后 LC3-Ⅱ/Ⅰ較對照組明顯增強(p＜0.05);自噬抑制后LC3-Ⅱ/Ⅰ較單純?nèi)毖踅M明顯減弱(P ＜0.05)(圖2，表3)。

圖2 3MA抑制缺氧誘導的自噬Fig 2 3MA inhibits autophagy induced by anoxia

表3 各組中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的吸光度值Table 3 The average optical density(A)value in control，anoxia and anoxia+3MA group，n=3)

表3 各組中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的吸光度值Table 3 The average optical density(A)value in control，anoxia and anoxia+3MA group，n=3)

*P ＜0.05 compared with control;#P ＜0.05 compared with anoxia．

expression of protein control anoxia anoxia+3MA LC3-Ⅰ20±2 22±3 21±2 LC3-Ⅱ 2±0.1 9±0.3* 5±0.1#

缺氧后促凋亡蛋白Bim和caspase-3表達較對照組顯著上調(diào)(p＜0.05)，而抑制自噬后Bim和caspase-3表達較單純?nèi)毖踅M顯著增加(p＜0.05);缺氧刺激顯著上調(diào)HIF-1表達(p＜0.05)，抑制自噬后HIF-1表達較單純?nèi)毖踅M明顯下降。(圖3)。

3 討論

自噬是維持自穩(wěn)、保證生存的重要生理過程之一，自噬在缺血性心臟病中的作用一直是研究探索的熱點。本實驗成功構(gòu)建了心肌細胞缺氧模型，缺氧8 h自噬顯著增強。研究表明缺血誘導的自噬具有心肌保護作用。例如，大鼠急性心肌缺血模型中，電鏡下觀察到缺血心肌組織中有自噬泡形成，增強自噬后心肌梗死面積顯著減少，并在梗死邊緣存活的心肌組織內(nèi)看到大量自噬泡［4］，其可能機制是:缺血導致AMP/ATP比值升高激活AMPK，降解無功能的蛋白質(zhì)、脂肪酸等物質(zhì)為細胞提供營養(yǎng)和能量［5］;也有研究證實可能是自噬增強后清除受損線粒體減少Cytc釋放，從而延遲或者抑制凋亡，發(fā)揮心肌保護作用［6］。

圖3 各組中促凋亡蛋白Bim、caspase-3和HIF-1的表達Fig 3 The protein expression of Bim，caspase-3 and HIF-1 in control，anoxia and anoxia+3MA group

然而，很少有研究探索缺氧過程中自噬的心肌保護作用與下調(diào)促凋亡蛋白Bim和caspase-3表達抵抗凋亡有關(guān)。在心肌細胞中，主要涉及到受體介導的外凋亡途徑和線粒體介導的內(nèi)凋亡途徑［7－8］。Bim屬于BCL-2家族中的一員，作為促凋亡蛋白介導線粒體凋亡途徑［9］。caspase屬半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族，是內(nèi)外凋亡途徑的交匯點，其中caspase-3則是凋亡的最終執(zhí)行者［10］。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3MA)是一種廣泛運用的自噬抑制劑［1］，本實驗中3MA顯著抑制缺氧誘發(fā)的自噬，這一結(jié)果也支持先前的研究［11］。本研究表明，缺氧誘發(fā)自噬下調(diào)促凋亡蛋白Bim和caspase-3表達發(fā)揮抗凋亡作用，而一旦抑制自噬后顯著減弱這種自噬的心肌保護作用。

此外，本實驗進一步探索了缺氧誘導自噬發(fā)揮抗凋亡作用中，HIF-1的正調(diào)控作用。HIF-1是一種在缺氧缺血過程中由低氧刺激激活的轉(zhuǎn)錄因子。先前的研究證實，在腎臟、腦組織和癌細胞中，HIF-1都能調(diào)控缺氧誘導的自噬，其可能機制是HIF-1能介導BCL-2和BNIP3相互作用，導致選擇性的線粒體自噬，或者通過抑制m-TOR誘發(fā)自噬［12］。本研究證實，HIF-1正調(diào)控大鼠乳鼠心肌細胞缺氧誘導的自噬發(fā)揮抗凋亡作用，而這一心肌保護機制有望成為缺血性心臟病治療的一個新靶點。但心肌缺血過程中HIF-1精細調(diào)控細胞自噬的機制及其上游信號調(diào)控分子還不十分明確，我們在下一步將進行更具體的研究和探索。

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