戚武林，胡江江，曹玲玲，趙輔昆，張世馥

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)與分子酶學(xué)研究室，浙江杭州310018)

多糖生物合成域1蛋白(polysaccharide biosynthesis domain-containing 1，PBDC1)含有198個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為22.2 ku。在丁酸鈉(sodium butyrate，SB)［1－2］誘導(dǎo)小鼠紅白血病(murine erythroleukemia，MEL)細(xì)胞［3］分化的差異蛋白質(zhì)組中，發(fā)現(xiàn)了PBDC1蛋白含量在細(xì)胞紅系分化過(guò)程中逐漸下調(diào)。由此推測(cè)，PBDC1蛋白可能與誘導(dǎo)的MEL細(xì)胞分化有關(guān)。鎳柱親和層析的原理是利用蛋白質(zhì)表面的組氨酸能與Ni2+發(fā)生特殊的相互作用，能夠吸附富含組氨酸的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)含有6×His標(biāo)簽的PBDC1融合蛋白，通過(guò)鎳離子親和柱純化得到PBDC1融合蛋白，并免疫新西蘭大白兔制備其多克隆抗體，為研究PBDC1蛋白在紅系分化中的功能提供有利工具。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌E．coli BL21(DE3)和pET-28a(+)質(zhì)粒(本研究室保存);MEL細(xì)胞(上海生命科學(xué)研究院);DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司);質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒(Qiagen公司);DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ和 XhoⅠ(Takara公司);異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、弗氏完全佐劑與不完全佐劑(Sigma公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司);鎳離子親和層析介質(zhì)(上海生工生物工程公司);其他試劑均為分析純;引物合成、DNA測(cè)序(上海桑尼生物科技有限公司);質(zhì)譜鑒定(本研究室完成);免疫用新西蘭大白兔為普通級(jí)，體質(zhì)量約2.5 kg，雄性，來(lái)源于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［合格證號(hào)SCXK(浙)2009-0039］。

1.2 PBDC1基因的獲得

MEL細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，收集細(xì)胞，提取RNA［4］，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)PBDC1基因序列，設(shè)計(jì)上游引物:5'-CGGAATTCATGGATGCTGCCGGCGA-3'(下劃線(xiàn)部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物:5'-CCGC TCGAGCTACTTTTCTCCTTCTCTGTTGGCTC-3'(下劃線(xiàn)部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增PBDC1基因。PCR反應(yīng)條件為:94℃變性30 s，57 ℃ 退火 30 s，68 ℃ 延伸 1 min，共 30 個(gè)循環(huán);再68℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳回收PBDC1基因片段。

1.3 pET-28a(+)-PBDC1表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將pET-28a(+)質(zhì)粒與PBDC1基因分別用EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切，將回收的基因片段與載體通過(guò)T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后篩選克隆，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定以及測(cè)序分析。

1.4 PBDC1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將篩選到的含陽(yáng)性克隆的BL21(DE3)菌株接種到4 mL含50 mg/L Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;再將培養(yǎng)物按1∶100的比例接種至400 mL含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，使培養(yǎng)液的A600值達(dá)到0.5～0.7，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，最后離心收集菌體。

1.5 PBDC1蛋白的純化

將收集得到的菌體重懸于裂解緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L 咪 唑，pH 8.0)中，冰浴并超聲波破碎后，離心收集上清，上樣于鎳離子親和層析柱，用洗滌緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，0.3 mol/L NaCl，40 mmol/L 咪 唑，pH 8.0)洗柱，除去非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，最后用洗脫緩沖 液 (50 mmol/L NaH2PO4，0.3 mol/L NaCl，100 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脫，收集目的蛋白溶液，并通過(guò)SDS-PAGE來(lái)檢測(cè)純化結(jié)果。

1.6 PBDC1多克隆抗體的制備

將純化得到的PBDC1蛋白通過(guò)脫鹽、濃縮用于免疫兔，首次免疫500μg蛋白，之后每隔7 d加強(qiáng)免疫1次，抗原量減半，頸部皮下多點(diǎn)注射，共加強(qiáng)免疫3次。首次免疫用弗氏完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑乳化。末次免疫7 d后頸動(dòng)脈取血，收集血清。

1.7 多克隆抗體的Western blot鑒定

用純化的PBDC1蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，然后用上述制備的多克隆抗體(TBST稀釋?zhuān)♂尪葹?∶10 000)4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育2 h，最后用化學(xué)發(fā)光法顯色。

2 結(jié)果

2.1 目的基因PBDC1擴(kuò)增

以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出1條600 bp左右的條帶(圖1)，與預(yù)期基因片段長(zhǎng)度一致。

2.2 重組質(zhì)粒p ET-28a(+)-PBDC1的鑒定

PCR鑒定和雙酶切鑒定結(jié)果顯示均在約600 bp處可見(jiàn)一條帶，大小與預(yù)期相符(圖2)，經(jīng)DNA測(cè)序證明序列完全正確。陽(yáng)性克隆命名為BL21/pET-28a(+)-PBDC1。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定及雙酶切鑒定Fig 2 Identification of recombinant plasmid by PCR and enzyme digestion

2.3 PBDC1蛋白的表達(dá)及可溶性分析

BL21/pET-28a(+)-PBDC1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在約27 ku處存在大量表達(dá)的蛋白，與預(yù)期大小相符。PBDC1蛋白在大腸埃希菌中為可溶性表達(dá)(圖3)。

2.4 PBDC1蛋白的純化及鑒定

純化得到的PBDC1融合蛋白純度較高，其相對(duì)分子質(zhì)量約為27 ku(圖4)，進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜鑒定證實(shí)該蛋白確實(shí)是PBDC1蛋白。

2.5 多克隆抗體的Western blot鑒定

Western blot結(jié)果表明在25 ku和35 ku之間存在特異性條帶，表明制備得到的抗PBDC1蛋白的抗體能與PBDC1蛋白發(fā)生免疫印跡反應(yīng)(圖5)。

3 討論

圖3 PBDC1蛋白的融合表達(dá)及可溶性分析Fig 3 Expression of PBDC1 fusion protein and its soluble analysis

圖4 SDS-PAGE檢測(cè)純化的PBDC1融合蛋白Fig 4 Identification of purified PBDC1 fusion protein by SDS-PAGE

圖5 多克隆抗體的Western blot鑒定Fig 5 Identification of polyclonal antibody by Western blot

PBDC1是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白。目前，有關(guān)它的特性及功能尚不了解。在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化的差異蛋白質(zhì)組中，發(fā)現(xiàn)PBDC1蛋白含量在細(xì)胞分化過(guò)程中逐漸下調(diào)。由此推測(cè)PBDC1蛋白參與了紅系分化過(guò)程，可能是紅系分化的一個(gè)潛在的調(diào)控因子。然而，目前還沒(méi)有商品化的PBDC1抗體。為了研究它在MEL細(xì)胞分化中的功能，本研究擬將PBDC1基因片段插入pET-28a(+)載體，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出大量、可溶的PBDC1融合蛋白。通過(guò)鎳離子親和層析柱分離純化得到含His標(biāo)簽的重組蛋白。PBDC1蛋白免疫新西蘭大白兔制備了抗PBDC1蛋白的多克隆抗體，為后續(xù)深入研究相關(guān)蛋白功能提供實(shí)驗(yàn)材料。

［1］Santini V，Gozzini A，Scappini B，et al．Searching for the magic bullet against cancer:the butyrate saga［J］．Leuk Lymphoma，2001，42:275 －289．

［2］Grebenova D，Kuzelova K，Pluskalova M，et al．The proteomic study of sodium butyrate antiproliferative/cytodifferentiation effects on K562 cells［J］．Blood Cells Mol Dis，2006，37:210－217．

［3］Friend C．Leukemia of adult mice caused by a transmissible agent［J］．Ann N Y Acad Sci，1957，68:522 －532．

［4］J．薩姆布魯克，D．W．拉塞爾．分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］．3版，北京:科學(xué)出版社，2002:518－522．