王 濤，劉躍華，鄭和義，左亞剛，方 凱

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科，北京，100730)

*通信作者(corresponding author):yuehualiu@263．net

BCL-2基因是與細胞凋亡關(guān)系密切的原癌基因之一。BCL-2/IgH融合基因可導(dǎo)致BCL-2蛋白的過度表達，可能是淋巴瘤發(fā)病和發(fā)展的機制之一。既往有研究顯示，BCL-2/IgH在淋巴瘤的輔助診斷、檢測療效、評估化療、預(yù)防復(fù)發(fā)和評估預(yù)后等方面有重要的作用。紫外線光療治療蕈樣肉芽腫(Mycosis Fungoides，MF)引起的BCL-2蛋白表達下降究竟是由于何種機制所致，目前并不清楚。有研究顯示光療后早期MF患者皮損組織中BCL-2蛋白表達顯著下降。但有作者認為補骨脂聯(lián)合紫外線A治療(Psoralen plus Ultraviolet A，PUVA)治療后MF皮損組織中BCL-2蛋白變化與臨床和病理改變并不相關(guān)［1］。綜上，針對光療后MF組織中BCL-2變化的更深入的研究很有必要，檢測BCL-2/IgH是否在MF患者體內(nèi)高表達，甚至光療前后其表達變化與否值得深究。

本研究采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法檢測早期MF經(jīng)紫外線光療前后BCL-2/IgH融合基因出現(xiàn)的可能變化，探索此方法在評價光療療效和預(yù)后的可能性。

1 材料與方法

1.1 對象:24例早期MF患者經(jīng)PUVA或NB-UVB及PUVA治療緩解后聯(lián)合NB-UVB等3種治療前后48份皮損處石蠟包埋組織標本。

以正常人DNA模板為陰性對照，以β-actin為內(nèi)參照，以預(yù)實驗中陽性標本為陽性對照。

1.2 主要試劑盒及來源:FFPE DNA Kit(CW547，康為世紀公司);SYBR? Premix EX TaqTM和 ROX Reference Dye(×50)(TaKaRa)。

1.3 方法:用熒光定量PCR檢測BCL-2/IgH融合基因。根據(jù)試劑盒說明配制PCR反應(yīng)體系。1)熒光定量PCR反應(yīng)體系(冰上配制，20μL)及引物序列，BCL-2/IgH引物序列按照文獻報道［2］由生工生物工程(上海)有限公司合成，內(nèi)參基因β-actin引物序列由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。2)熒光定量 PCR反應(yīng):預(yù)變性95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃30 s，循環(huán)數(shù)60個;變性95℃ 15 s，退火延伸60℃ 1 min，95℃ 15 s;熔解曲線程序:95℃ 15 s，50℃ 15 s，95℃ 15 s。每個標本對應(yīng)于每個基因，重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析:以同一個樣本目的基因Ct值與β-actin Ct值的差值△Ct，即△Ct=Cttarget－ Ctβ-actin，得出目的基因在同一對標本治療前后表達的倍數(shù)關(guān)系，即Ntarget=2－(△Ctpro－△Ctpost)，當(dāng)Ntarget≥2時被認為治療前相對于對應(yīng)治療后高表達，而當(dāng)Ntarget≤1/2時，則認為治療前相對于治療后目的基因表達下調(diào)。設(shè)定正常對照者CT均值為設(shè)定的檢測限，研究方法檢測的假陽性率為0，樣本CT值大于或等于正常對照者設(shè)為陰性表達，小于者為陽性表達。熒光定量PCR結(jié)果采用Fisher's確切概率法或t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson卡方檢驗分析R值。

2 結(jié)果

共20例患者DNA及RQ-PCR均取得預(yù)期值。治療前后早期MF患者皮損中BCL-2/IgH擴增前后無差異。治療前BCL-2/IgH陽性者為4例，治療后為3例，治療前后陽性率無差異;N值與復(fù)發(fā)率相關(guān)性分析:N≥2者與治療有效與否無相關(guān)性;N≤1/2者與治療復(fù)發(fā)與否無相關(guān)性(表1、2，圖 1)。

3 討論

本研究治療前BCL-2/IgH融合基因陽性率僅為20%，與既往研究結(jié)果類似［3］。早期MF患者經(jīng)紫外線光療后，BCL-2/IgH相對的基因拷貝數(shù)可出現(xiàn)顯著性變化，但治療后出現(xiàn)BCL-2/IgH高表達者，與復(fù)發(fā)率之間無相關(guān)性，而治療后拷貝數(shù)下調(diào)，與療效之間無相關(guān)性。這種現(xiàn)象說明，光療后早期MF患者體內(nèi)BCL-2蛋白表達下降可能是腫瘤細胞減少后的非特異性結(jié)果，出現(xiàn)這種下調(diào)的原因可能不是光療引起B(yǎng)CL-2/IgH融合基因變化，可能還存在其他的機制而導(dǎo)致光療后BCL-2蛋白表達下降而下調(diào)其誘導(dǎo)的抗凋亡作用。也說明BCL-2/IgH融合基因不適合作為監(jiān)測紫外線光療治療早期MF病情變化、療效評價和監(jiān)測預(yù)后的指標。

表1 BCL-2/IgH擴增結(jié)果Table 1 Amplification results of BCL-2/IgH(x±s，n=20)

表2 ΔCT值及N值Table 2 Value ofΔCT and N(x±s，n=20)

圖1 溶解曲線Fig 1 Solubility curve

［1］Weshahy H，Mahgoub D，El-Eishy N，et al．BCL-2 expression in mycosis fungoides before and after PUVA therapy［J］．Photodermatol Photoimmunol Photomed，2010，26:107－109．

［2］張學(xué)美，徐明，劉華，等．實時定量PCR法檢測淋巴瘤患者BCL-2/IgH融合基因及其臨床意義［J］．中國實驗血液學(xué)雜志，2009:368－372．

［3］Garcia MJ，Martinez-Delgado B，Granizo JJ，et al．IgH，TCR-gamma，and TCR-beta gene rearrangement in 80 B-and T-cell non-Hodgkin's lymphomas:study of the association between proliferation and the so-called“aberrant”patterns［J］．Diagn Mol Pathol，2001，10:69－77．