紀(jì)春梅，甄永占，范曉禹，王志軍，蔣守芳，朱麗華，章廣玲

大黃酸(rhein)是許多中藥尤其是大黃的主要有效成分。可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，具有廣泛的生物學(xué)活性［1－3］。蒽醌類(lèi)化合物的共同特點(diǎn)是不溶于水，限制了其在腫瘤治療方面的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)大黃酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得了水溶性好的賴(lài)氨大黃酸(rhein lysinate，RHL)。本研究觀(guān)察RHL聯(lián)合順鉑對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制，為今后大黃酸在腫瘤治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞系

1.1.1 試劑:賴(lài)氨酸(北京市科海軍舟生物科技發(fā)展中心)。賴(lài)氨大黃酸(rhein lysinate，RHL)由本室合成，分子式:C21H22N2O8，相對(duì)分子質(zhì)量:430，純度93%;順鉑(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所);蛋白定量試劑盒(BCATMprotein assay kit)(Pierce公司產(chǎn)品);寬范圍蛋白預(yù)染 Marker(New England Biolabs公司);蛋白質(zhì)印跡發(fā)光液和PVDF膜(Millipore公司);FITC-AnnexinⅤ 凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司);BCL-2抗體(sc-492)、BAX 抗體(sc-493)、β-actin抗體(sc-1616)(Santa Cruz公司);HRP標(biāo)記的羊抗兔、兔抗羊和羊抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋有限責(zé)任公司);絲裂原活化蛋白激酶家族成員抗體試劑盒、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶家族成員抗體試劑盒和凋亡相關(guān)分子抗體試劑盒(Cell Signaling Technology公司)。

1.1.2 細(xì)胞系分組及處理:人肺癌細(xì)胞系(A549)由河北聯(lián)合大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存。用含10%胎牛血清(Hyclone)的高糖DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分對(duì)照組、1μmol/L順鉑組、100μmol/L RHL組以及1μmol/L順鉑和100 μmol/L RHL 聯(lián)合用藥組［4－5］。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖活性檢測(cè):應(yīng)用MTT法檢測(cè)定細(xì)胞存活率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，輕輕吹打分散成細(xì)胞懸液，記數(shù)后以4×103個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL培養(yǎng)液，24 h后分別加入1μmol/L的順鉑、100μmol/L的RHL以及1μmol/L的順鉑和100μmol/L的RHL聯(lián)合用藥處理48 h，每組至少3個(gè)平行孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前加入5 g/L MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸去上清液，加入二甲基亞砜150 mL，振蕩溶解結(jié)晶后用酶標(biāo)儀(Thermo Labsystems公司，Multiskan MK3)于570 nm 處測(cè)定每個(gè)孔的吸光度(A570)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)無(wú)藥對(duì)照孔和無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔各3孔，按下面公式計(jì)算細(xì)胞的存活率:細(xì)胞存活率=(加藥組A570值－空白組A570值)/(對(duì)照組A570值 －空白組 A570值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞3 mL按5×104個(gè)/孔種于6孔板，24 h后分別加入順鉑、RHL以及順鉑和RHL聯(lián)合用藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，按說(shuō)明書(shū)操作，在流式細(xì)胞檢測(cè)儀上檢測(cè)凋亡。

1.2.3 蛋白質(zhì)提取及Western blot檢測(cè):分別收集順鉑、RHL以及順鉑和RHL聯(lián)合用藥作用48 h及未加藥處理的A549細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗3遍，加入新鮮配制的細(xì)胞裂解液(50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸，pH 7.5;1%NP-40;150 mmol/L NaCl;1 mmol/L Na3VO4;1 mmol/L NaF，臨用時(shí)加入3種蛋白酶抑制劑:1% 抑蛋白酶肽;10 g/L亮抑酶肽;1 mmo/L苯甲基磺酰氟)100μL，細(xì)胞與裂解液充分混合，冰浴20 min。于4℃、13 000 r/min離心15 min，收集上清液于新的微量離心管中，采用BCA法測(cè)定蛋白含量。取各樣品等量總蛋白30μg加入0.25倍體積的5×上樣緩沖液，煮沸變性5 min后，在10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)膠上進(jìn)行電泳。然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，1% 牛血清白蛋白封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜后，加相應(yīng)二抗孵育2 h，膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(Santa Cruz biotechnology SC-2048)，按照試劑說(shuō)明進(jìn)行操作，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)拍照保存結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單因素方差分析比較各組間的差異，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間比較。

2 結(jié)果

2.1 順鉑和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用后細(xì)胞增殖率

給藥48 h后，順鉑和RHL聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制作用明顯高于順鉑和RHL單獨(dú)用藥組，順鉑和RHL單獨(dú)用藥組對(duì)細(xì)胞的增殖也有抑制作用(p＜0.05)，順鉑和RHL聯(lián)合用藥后對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用明顯提高(p＜0.05)(圖1)。

圖1 順鉑和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用后細(xì)胞增殖率Fig 1 Growth inhibition of A549 cells treated with cisplatin，RHL，and a combination of both

2.2 順鉑和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用后細(xì)胞凋亡率

順鉑和RHL單獨(dú)用藥組的細(xì)胞凋亡率分別為18.86% ±1.20%和22.38% ±1.50%，均顯著高于對(duì)照組的2.81% ±0.50%(p＜0.05)，順鉑和RHL聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率為52.51% ±1.90%，均顯著高于單獨(dú)用藥組(p＜0.05)(圖2)。

2.3 Western blot法檢測(cè)順鉑和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白和ERK的表達(dá)水平

順鉑組磷酸化的ERK蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，RHL組磷酸化的ERK蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯變化，而順鉑聯(lián)合RHL組磷酸化的ERK的表達(dá)水平明顯低于單獨(dú)應(yīng)用順鉑組。順鉑聯(lián)合RHL組的caspase-3、caspase-7和poly ADP-ribose polymerase(PARP)的切割片段蛋白表達(dá)水平高于順鉑組和RHL組(圖3)。

2.4 Western blot法檢測(cè)順鉑和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用細(xì)胞后BCL-2和BAX蛋白的表達(dá)水平

順鉑和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用細(xì)胞48 h后，聯(lián)合組的BCL-2的表達(dá)水平低于單獨(dú)用藥組，而B(niǎo)AX的表達(dá)水平高于單獨(dú)用藥組(圖4)。

圖2 順鉑和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用后細(xì)胞凋亡率Fig 2 Apoptosis of A549 after treated with cisplatin，RHL and a combination of both

圖4 A549細(xì)胞BCL-2和BAX蛋白的表達(dá)水平Fig 4 Expression levels of BCL-2 and BAX in A549 cells detected

圖3 A549細(xì)胞ERK和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig 3 Expression levels of protein associated with apoptosis and ERK in A549 cells detected

3 討論

肺癌已成為我國(guó)前10位惡性腫瘤死亡率的第1位，在許多國(guó)家也是首位的癌癥致死原因。化療在肺癌的綜合治療中占據(jù)著重要的地位，順鉑作為肺癌化療中常用的藥物，雖有一定的效果，因其對(duì)正常組織的毒性和耐藥性，所以仍不夠理想，故尋找高效低毒的腫瘤化療增敏劑以增強(qiáng)順鉑的化療效果，改善患者的生存率成為研究熱點(diǎn)。

大黃酸是許多中藥尤其是大黃的主要有效成分?？梢种贫喾N腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，具有廣泛的生物學(xué)活性［1－3］。對(duì)大黃酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得了水溶性好的RHL，并證實(shí)RHL保留了抗腫瘤活性［6－8］。本研究發(fā)現(xiàn):順鉑和 RHL均能抑制肺癌A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但兩藥聯(lián)合后增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用顯著高于單用順鉑或RHL;兩藥聯(lián)合進(jìn)一步增加了 A549細(xì)胞 caspase-3、caspase-7和PARP的切割片段蛋白表達(dá)。提示RHL能夠通過(guò)調(diào)控caspases家族增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合顯著下調(diào)了BCL-2蛋白的表達(dá)，而B(niǎo)AX蛋白的表達(dá)升高。BCL-2是一種抗凋亡蛋白，BAX是促凋亡蛋白，BCL-2/BAX的比例決定細(xì)胞的生存與凋亡［9］。同時(shí)RHL還能降低順鉑上調(diào)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)蛋白磷酸化。ERK的激活有利于細(xì)胞生存，也是腫瘤耐藥的常見(jiàn)原因［10－12］。

綜上所述，RHL能夠通過(guò)抑制順鉑對(duì)ERK的激活增強(qiáng)順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡誘導(dǎo)作用?？梢?jiàn)RHL不僅自身有抗肺癌作用，而且還可以增強(qiáng)順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞的殺傷作用和凋亡誘導(dǎo)作用，減少毒副作用，進(jìn)一步研究RHL和順鉑兩者聯(lián)合治療肺癌的作用機(jī)制和作用途徑，可能為肺癌的綜合防治提供新思路、新線(xiàn)索和新方法。

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