李彩麗，陳 靜，王 蓓，王菲菲，田寶瑩，謝 蓓，范臨蘭，魏虎來

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000，2.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，甘肅蘭州 730030)

自噬(autophagy)是細(xì)胞在缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、藥物等代謝壓力下，通過降解其自身細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)、細(xì)胞器和胞質(zhì)的“自我消化”過程:粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無(wú)核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，降解其所包裹的內(nèi)容物，達(dá)到清除受損物和能量再利用的目的［1－2］。三氧化二砷(Arsenic trioxide，As2O3)已在臨床上成功用于急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的治療［3］。同時(shí)，As2O3對(duì)其它血液腫瘤、淋巴瘤及實(shí)體瘤也有較好的療效［4－6］。我們的前期研究證實(shí)，As2O3可有效誘導(dǎo)白血病和腫瘤細(xì)胞凋亡［7－9］。As2O3能否誘導(dǎo)惡性淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生自噬以及細(xì)胞自噬在As2O3殺傷惡性淋巴瘤細(xì)胞中的作用尚不清楚。本文以Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞為研究對(duì)象，研究自噬活性在As2O3誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 As2O3(美國(guó)Sigma公司)用0.1 mol·L－1NaOH溶解，調(diào)整溶液pH值，PBS配制成10 mmol·L－1的貯存液;自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin，Rapa)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，3-MA用PBS配制成100 mmol·L－1貯存液，分裝避光冰凍保存;Rapa用DMSO配成2 mmol·L－1貯存液。單丹黃酰尸胺(monodansyl cadaverine，MDC)、MTT均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海蔚宏生物科技有限公司);TRIzol購(gòu)自 Invitrogen公司，β-actin、Bcl-2和 p53引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成;細(xì)胞裂解液 RIPA試劑盒、蛋白定量BCA試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;PVDF膜(美國(guó)Millipore公司);微管相關(guān)蛋白1輕鏈-3(LC-3)抗體、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;Raji細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 Raji細(xì)胞以5×107·L－1接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組:對(duì)照組、As2O3作用組、3-MA聯(lián)合 As2O3組和 Rapa聯(lián)合As2O3組，其中3-MA 聯(lián)合As2O3組用4 mmol·L－13-MA預(yù)先處理細(xì)胞3 h后再加入As2O3。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107·L－1，接種于96孔培養(yǎng)板中，每組6個(gè)復(fù)孔，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)不同時(shí)間后，每孔加入MTT(5 g·L－1)10 μl，再繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，每孔加 10%SDS 過夜，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Tek X，Bio-Tek公司，美國(guó))檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下的吸光度A值，根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:

1.2.3 Annexin-V/PI雙標(biāo)記染色檢測(cè)凋亡 根據(jù)MTT結(jié)果，選用3 μmol·L－1As2O3單獨(dú)及聯(lián)合 3-MA或Rapa作用48h，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC和PI(propidium iodide)，室溫避光孵育，流式細(xì)胞儀(Coulter Epics XL，Beckman-Coulter，美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞周期測(cè)定 收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，用70%乙醇4℃固定過夜，再用PBS洗滌細(xì)胞2次，加PI和RNase，避光室溫放置30 min，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，3%戊二醛固定，1%四氧化鋨固定，梯度丙酮脫水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡(JEM-1230，日本電子公司)觀察細(xì)胞凋亡及自噬的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.6 MDC熒光染色觀察自噬體 MDC能選擇性地結(jié)合到自噬囊泡膜上而被用來檢測(cè)自噬的發(fā)生［10］。收集細(xì)胞加入 0.05 mmol·L－1MDC 于37℃避光孵育1 h，PBS洗，離心涂片機(jī)離心涂片后熒光顯微鏡(AX80，OLYMPUS，日本)下觀察［7］。

1.2.7 Western blot檢測(cè) LC-3Ⅰ/Ⅱ蛋白水平 收集細(xì)胞用RIPA試劑裂解，細(xì)胞裂解上清液經(jīng)SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉后加入LC-3和β-actin抗體共同孵育1.5 h，加入IRDye700DX和IRDye800CW標(biāo)記二抗室溫孵育，紅外熒光成像系統(tǒng)(Odyssey，LI-COR，美國(guó))分析條帶熒光強(qiáng)度。

1.2.8 定量RT-PCR檢測(cè)bcl-2和p53 mRNA的表達(dá)水平 收集5×105細(xì)胞，TRIzol法裂解提取細(xì)胞總RNA，依據(jù)SuperScriptⅡ RT First-Strand試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Rotor-Gene 3000，Corbett，澳大利亞)進(jìn)行定量擴(kuò)增?；虮磉_(dá)定量通過分析軟件Rotor-Gene 6.0采用比較閾值法進(jìn)行分析。目的基因的相對(duì)表達(dá)量F=2－ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct管家基因－ Ct目的基因)對(duì)照－ (Ct管家基因－Ct目的基因)實(shí)驗(yàn)組。收集PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 As2O3誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞自噬活化 Raji細(xì)胞經(jīng)3 μmol·L－1As2O3作用48 h，電鏡觀察呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)在胞質(zhì)內(nèi)可見大量自噬體形成(如Fig 1箭頭所示);MDC熒光染色在細(xì)胞核周區(qū)域可出現(xiàn)大量點(diǎn)塊狀熒光，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度比對(duì)照細(xì)胞明顯增強(qiáng);LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化是細(xì)胞自噬的特異性標(biāo)志，蛋白印跡法檢測(cè)顯示LC3-Ⅱ蛋白的量明顯增高(Fig 2)。提示As2O3可誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生自噬活化。同時(shí)，自噬抑制劑3-MA明顯抑制As2O3誘導(dǎo)的自噬活性，而自噬誘導(dǎo)劑Rapa則可進(jìn)一步提高As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平(Fig 1、2)。

2.2 As2O3單獨(dú)及聯(lián)合3-MA或Rapa對(duì)Raji細(xì)胞增殖活性的影響 As2O3對(duì)Raji細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，呈時(shí)間、濃度依賴性(P＜0.05)，24、48和72 h的IC50值分別是(3.51±0.13)、(1.57±0.32)、(1.03 ±0.08)μmol·L－1(Fig 3)。3-MA 預(yù)處理抑制Raji細(xì)胞自噬，可明顯降低Raji細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性，IC50值分別增加了38.2%、41.4%和60.2%;而Rapa誘發(fā)Raji細(xì)胞自噬則增高Raji細(xì)胞對(duì) As2O3的敏感性，其 IC50值分別降低了30.5%、12.1% 和9.7%(Fig 4)。在我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，4 mmol·L－13-MA 和 2 μmol·L－1Rapa 單獨(dú)作用，其對(duì) Raji細(xì)胞增殖活性的最高抑制率小于12%，說明本文中所用濃度的3-MA和Rapa對(duì)Raji細(xì)胞僅有極輕微的毒性效應(yīng)。

2.3 As2O3單獨(dú)及聯(lián)合3-MA或Rapa對(duì)Raji細(xì)胞凋亡與周期的影響 如Fig 5所示，3 μmol·L－1As2O3作用48 h，Raji細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞減少、G2/M期細(xì)胞增高2.2倍，細(xì)胞總凋亡率為39.9%，提示As2O3可將細(xì)胞阻滯在G2/M期和誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生凋亡。采用3-MA抑制細(xì)胞自噬活性，As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞總凋亡率降低約50%，G0/G1期細(xì)胞增加、G2/M期細(xì)胞降至對(duì)照細(xì)胞水平，說明3-MA抑制自噬活性可逆轉(zhuǎn)As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯，降低Raji細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性。與此相反，采用Rapa促進(jìn)細(xì)胞自噬活性，As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率增高約50%;G0/G1期細(xì)胞降低1.6倍而G2/M期細(xì)胞則增加1.8倍。提示Rapa誘導(dǎo)自噬可促進(jìn)As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，提高Raji細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性。

Fig 1 Effect of 3-MA or Rapa on autophagic activity of Raji cells induced by As2O3

Fig 2 Effect of 3-MA or Rapa on conversion of LC3-I to LC3-IIin Raji cells induced by As2O3

2.4 As2O3單獨(dú)及聯(lián)合3-MA或Rapa對(duì)Raji細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 抗凋亡基因bcl-2既可抑制凋亡，又可與自噬相關(guān)蛋白結(jié)合而抑制細(xì)胞自噬［11］。RT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3 μmol·L－1As2O3明顯下調(diào)Raji細(xì)胞bcl-2 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)。3-MA預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)As2O3誘導(dǎo)的bcl-2 mRNA的表達(dá)降低，而Rapa則進(jìn)一步降低As2O3下調(diào)的bcl-2 mRNA表達(dá)水平(Fig 6)。研究結(jié)果提示As2O3誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡與其抑制bcl-2基因表達(dá)有關(guān)，3-MA和Rapa可通過調(diào)控bcl-2基因和細(xì)胞自噬，調(diào)節(jié)As2O3誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞死亡。

Fig 3 Anti-proliferative effects of As2O3on Raji cells

Fig 4 Sensitivity of Raji cells to As2O3after regulation of autophagy activity by 3-MA or Rapa

Fig 5 Effect on As2O3-induced apoptosis and cell-cycle arrest in Raji cells after regulation of autophagy activity by 3-MA or Rapa

Fig 6 Expression of bcl-2 mRNA in Raji cells induced by As2O3alone or in combination with 3-MA or Rapa

2.5 As2O3聯(lián)合3-MA 或 Rapa對(duì) Raji細(xì)胞 p53 mRNA表達(dá)的影響 細(xì)胞毒藥物可激活p53基因而抑制mTOR，促進(jìn)自噬小體形成和LC3脂化而誘發(fā)細(xì)胞自噬［12］。3 μmol·L－1As2O3可明顯增強(qiáng)Raji細(xì)胞p53 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)。3-MA可降低Raji細(xì)胞被As2O3增強(qiáng)的p53 mRNA的表達(dá)水平;相反，Rapa可加強(qiáng)As2O3對(duì)p53 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用(Fig 7)。上述結(jié)果提示3-MA可能通過降低p53基因表達(dá)而抑制細(xì)胞自噬活性進(jìn)而抑制As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而Rapa則通過促進(jìn)p53表達(dá)、激活自噬而增強(qiáng)As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Fig 7 Expression of p53 mRNA in Raji cells induced by As2O3alone or in combination with 3-MA or Rapa

3 討論

越來越多的研究證據(jù)表明，化療藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)［13］。目前有關(guān)自噬在腫瘤藥物治療中的作用及機(jī)制的研究結(jié)論尚存在矛盾。Sun等［14］用表柔比星誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)激活自噬可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，而抑制自噬則增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性;而Goussetis等［15］的研究證實(shí)自噬可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死等機(jī)制或直接誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，自噬的作用可能與腫瘤組織細(xì)胞類型和誘導(dǎo)發(fā)生自噬的藥物種類有關(guān)。

As2O3對(duì)白血病和實(shí)體腫瘤有較好的療效［4，6］，有研究表明As2O3可抑制淋巴瘤細(xì)胞的增殖，主要作用機(jī)制為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16］。有關(guān)自噬活性在As2O3誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞死亡中的作用尚未見報(bào)道。我們的研究證實(shí)As2O3在誘導(dǎo)Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞凋亡的同時(shí)可激活細(xì)胞自噬，采用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑Rapa分別抑制或增強(qiáng)細(xì)胞的自噬活性，則可明顯降低或提高Raji細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性。上述研究結(jié)果強(qiáng)烈提示自噬在As2O3誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

Bcl-2主要通過與Beclin-1之間的相互作用抑制細(xì)胞自噬，而p53參與細(xì)胞自噬的調(diào)控，細(xì)胞毒藥物激活p53可抑制mTOR通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬。同時(shí)，Bcl-2家族成員Bax、Bad和 Puma等可被 p53反式激活，解除Bcl-2/Bcl-xL和Beclin-1之間的抑制作用或磷酸化Beclin-1而增強(qiáng)細(xì)胞自噬［17］。因此，Bcl-2和p53不僅調(diào)控細(xì)胞凋亡，而且參與細(xì)胞自噬活性的調(diào)節(jié)。我們的研究證實(shí)，As2O3誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡過程中明顯抑制bcl-2基因和增強(qiáng)p53基因的表達(dá)。自噬抑制劑3-MA則可上調(diào)bcl-2基因表達(dá)和下調(diào)p53基因表達(dá)以及抑制細(xì)胞自噬活性，降低As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡;而自噬誘導(dǎo)劑Rapa的作用則與3-MA的效應(yīng)正好相反。提示在As2O3誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞凋亡和自噬中bcl-2基因和p53基因起著重要的調(diào)控作用，調(diào)節(jié)著Raji細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性。

綜合上述，細(xì)胞凋亡和自噬性細(xì)胞死亡共存于As2O3誘導(dǎo)的Raji淋巴瘤細(xì)胞死亡中，Bcl-2和p53可能起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。調(diào)控細(xì)胞的自噬水平可改變腫瘤細(xì)胞對(duì)As2O3敏感性的事實(shí)，有助于在臨床特定腫瘤的治療中輔助應(yīng)用特異性自噬抑制劑或誘導(dǎo)劑，探尋腫瘤治療的新途徑。

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