朱列書 詹莜國 郭東海 宋正雄 王祖富 尹佳

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中國煙草中南農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站,湖南長沙 410128;2.昆明市煙草公司,云南昆明 650202)

煙草正反交組合F1 SRAP的比較分析

朱列書1詹莜國2郭東海1宋正雄1王祖富1尹佳1

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中國煙草中南農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站,湖南長沙 410128;2.昆明市煙草公司,云南昆明 650202)

本文旨在利用SRAP 標(biāo)記對(duì)4X4完成雙列雜交煙草組合進(jìn)行差異比較,從遺傳層面鑒定正反交差異。100對(duì)SRAP引物組合中只有me3-em2、me4-em6、me6-em5、me10-em7引物組合能4 X 4個(gè)組合中擴(kuò)增出差異條帶,但是沒能在正反交F1之間擴(kuò)增出特異條帶。表明SRAP標(biāo)記在鑒別種內(nèi)之間的差異時(shí)效率不高。

烤煙 SRAP分子標(biāo)記 差異

0煙草(Nicotiana tabacum L.)為茄科煙屬一年生或多年生作物，為典型的自交作物，是最早應(yīng)用于分子生物學(xué)和基因工程研究的模式植物之一。但我國煙草種植品種單一化，嚴(yán)重阻礙了煙草產(chǎn)量和質(zhì)量的進(jìn)一步提高。究其原因除煙草育種目標(biāo)固有復(fù)雜性與特殊性以外，主要是煙草育種還依賴于植株的表型選擇及一些生理生化指標(biāo)的測定，未曾從遺傳的層面研究應(yīng)用科學(xué)問題，使煙草育種的進(jìn)展受到一定的限制。近年發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)克服了形態(tài)性狀研究的不足，不受發(fā)育時(shí)期的影響，結(jié)果可靠，因此被廣泛使用。而其它作物種，分子標(biāo)記輔助育種選擇體現(xiàn)了它的優(yōu)勢。

SRAP(Sequence-Related AmplifiedPolymorphism)標(biāo)記是Li和Quiros[96，97]在蕓苔屬植物上開發(fā)出的新型分子標(biāo)記技術(shù)，已在馬鈴薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、[98-100]中成功擴(kuò)增。其原理是利用特定引物對(duì)ORFs區(qū)域(Open Reading Frames)進(jìn)行擴(kuò)增。因不同個(gè)體、物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子及間隔區(qū)長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。目前，該技術(shù)已被用于甜瓜、南瓜、野牛草、辣椒和棉花[101]等的遺傳多樣性研究，顯示了良好的效果和適用性。

本文旨在利用SRAP標(biāo)記對(duì)4X4完成雙列雜交煙草組合進(jìn)行差異比較，從遺傳層面鑒定正反交差異。從分子水平了解煙草的遺傳變異和親緣關(guān)系，為合理選配親本，挖掘利用現(xiàn)有種質(zhì)資源提供理論指導(dǎo)；為加快我國煙草育種效率提供理論參考依據(jù)。

表1 4×3正反雜交組合

表2 親本的主要特征特性

1 材料與方法

1.1 材料

選用材料以紅花煙草(Nicotiana tabacum)中的DY87、長脖黃、T61、PVH06共4個(gè)烤煙品種為親本，按Griffing方法I進(jìn)行4×4完全雙列雜交，配制正反、交組合12個(gè)，連同親本共16個(gè)(見表1，表2)。

1.2 儀器與試劑

高速冷凍離心機(jī)(日本，Hitachi koki co，ltd)，核酸蛋白檢測儀(德國，Eppendorf，Biophometer)、紫外凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-1000)、HVE-50高壓滅菌鍋、電泳槽、移液槍(0.2-2μL、2-20μL、20-200μL、1mL)、超低溫冰箱、低溫冰箱、Biometra基因擴(kuò)增儀、電磁爐

表3 正向引物堿基序列

用于SRAP-PCR反應(yīng)的Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer(Mg2+15mM)購自東盛生物公司，標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker)DL100購自GenScript。SRAP引物由上海生物工程公司合成。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Tiangen公司。

1.3 基因組DNA的提取(CTAB法)與濃度測定

采集新鮮幼嫩的葉片約2g，放入研缽中，用液N2研磨成粉末，DNA的提取采用CTAB法，參考王關(guān)林、王宏建等[102]的方法并稍做改進(jìn)，提取步驟為：

①在CTAB提取液中先加入200μL的β-巰基乙醇，水浴鍋中預(yù)熱到65℃；

②往裝有粉碎樣品的離心管中加入65℃預(yù)熱的DNA的提取液[2%CTAB，100mmol Tris/HCl(pH8.0)，1.4mol NaCl，20mmolEDTA(pH8.0)，用前加40mmol/L β-巰基乙醇]4mL，輕輕搖晃均勻，在65℃水浴45min，每5min溫和翻轉(zhuǎn)一次；

③取出試管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)，溫和上下顛倒50次左右，至下層液相呈深綠色為止，于15℃，12000r/min離心10min；

④將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管，重復(fù)以上操作再用氯仿/異戊醇(24：1) 抽提一次；

⑤取上清液于離心管中，加入等體積的-20℃的異戊醇，溫和顛倒數(shù)次，-20℃冰箱中放置15min，于4℃，10000r/min 離心10min；

⑥倒掉液體后用75%的酒精清洗兩次后，于超凈工作臺(tái)上晾干，將晾干的DNA溶于100μLTE溶液中。

得到的DNA提取液用Eppendorf公司生產(chǎn)的BioPhotometer核酸檢測儀檢測DNA溶液濃度與純度，用0.8%的瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性，最后將樣品稀釋成20ng/μL，保存于-20℃下備用。

表4 反向引物堿基序列

表5 SRAP-PCR反應(yīng)各因素的水平

表6 PCR反應(yīng)的因素水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 PCR引物

SRAP是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種新型分子標(biāo)記，以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記系統(tǒng)的引物的一般設(shè)計(jì)原則也適用于SRAP：不能產(chǎn)生二聚體、不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)、GC含量在40%—60%等。SRAP標(biāo)記的引物分為正反兩種，正向引物長為17bp，由14bp的核心序列和3'端的3個(gè)可選擇性堿基組成，核心序列由5'端的10bp填充序列和緊接著的CCGG組成，3'端的3個(gè)堿基的變化能產(chǎn)生一系列的引物。反向引物長為17bp或18bp，組成與正向引物相同，核心序列長10bp或11bp，組成必須與正向引物不同，在核心序列與3'端可選擇性堿基之間是AATT，具體序列如下(如表3，4)：

1.5 PCR反應(yīng)因素水平的確定與體系設(shè)計(jì)

PCR反應(yīng)受多個(gè)因素影響，反應(yīng)復(fù)雜，為了確定PCR反應(yīng)中5個(gè)因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)的最佳水平，參考陳萬勝[103]的正交設(shè)計(jì)，簡化為三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，參加PCR反應(yīng)的因素水平見表3-3，設(shè)計(jì)方案見表5。

圖1 提取的總DNA

圖2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)SRAP-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 品種試驗(yàn)結(jié)果(me3-em2)

1.6 PCR擴(kuò)增與檢測

將表6的12個(gè)處理重復(fù)兩次，在Biometra基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序首先是94℃預(yù)變性5min；前5個(gè)循環(huán)程序?yàn)椋?4℃，1min，35℃，1min，72℃，2min；隨后的35個(gè)循環(huán)為：94℃，1min，53℃，1min，72℃，2min；最后72℃延伸5min，4℃保持。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6×點(diǎn)樣緩沖液混合，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1×TAE溶液，電壓80V，電泳時(shí)間約45min，電泳結(jié)束后在GelDoc-1000紫外凝膠成像系統(tǒng)上采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

DNA的提取質(zhì)量是決定SRAP-PCR成功與否的關(guān)鍵。改良的CTAB法提取的DNA經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測OD260/OD280為1.91±0.05，OD260/OD230為1.96±0.06，表明無多糖、蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)等雜質(zhì)干擾；經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA主帶明亮清晰(圖1)，點(diǎn)樣孔沒有雜質(zhì)遺留，得到的樣品純度比較高。

2.2 SRAP反應(yīng)體系的優(yōu)化

按表6設(shè)計(jì)的12個(gè)處理進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，所得到的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(圖2)。從圖可以看出，體系8、10、11和12擴(kuò)增的條帶數(shù)很少且不清楚，說明Tap酶單位和引物濃度加大效果并不理想；1、3和4能擴(kuò)增出一定數(shù)量的條帶，但是都不是很清晰，可以看出Tap酶1.0U偏少，dNTP濃度0.15mmol/L偏??；2號(hào)體系能擴(kuò)增出較多清晰的條帶，5、6和7也能擴(kuò)增出比較清晰的條帶，由此可以看出Tap酶為1.5U、Mg2+1.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L最好，引物濃度0.2μmol/L就可以了，DNA模板對(duì)結(jié)果影響并不很明顯，40ng能夠滿足體系擴(kuò)增要求。

2.3 應(yīng)用SRAP反應(yīng)體系擴(kuò)增不同烤煙品種基因組

采用優(yōu)化的SRAP反應(yīng)體系擴(kuò)增4×4完全雙列雜交16個(gè)烤煙品種(系)基因組，共擴(kuò)增了100對(duì)引物，每一對(duì)引物組合都能擴(kuò)增出一定數(shù)量的清晰條帶，但是其中有差異條帶的只有4對(duì)，它們分別是me3-em2、me4-em6、me6-em5、me10-em7，圖譜如下。在引物對(duì)me3-em2擴(kuò)增下親本T61與其他親本相比在大約700bp處缺少一個(gè)條帶；而組合“長脖黃×61”在1200bp處缺少條帶，但正反交(3號(hào)10號(hào))之間沒有條帶差異。14號(hào)親本PVH06在引物對(duì)me4-em6的擴(kuò)增下與其親本相比較在250bp處缺少條帶，由其組配的雜種沒有相應(yīng)的缺失條帶；同時(shí)其它正反交F1也沒有相應(yīng)的缺失。引物對(duì)Me6-em5能在親本T61中擴(kuò)增出兩個(gè)特異條帶，分別在大約在1500bp、900bp處。其組配的雜種F1沒有檢測到相關(guān)相同條帶，這可視為親本T61的特異標(biāo)記條帶。DY87在引物對(duì)me10-em7的擴(kuò)增下，在1500bp和1000bp兩處缺少條帶，正反交F1之間沒有檢測到條帶差異。

圖4 品種試驗(yàn)結(jié)果(me6-em5)

圖5 品種試驗(yàn)結(jié)果(me10-em7)

圖6 品種試驗(yàn)結(jié)果(me4-em6)

3 小結(jié)與討論

3.1 DNA提取與SRAP反應(yīng)體系

改良的CTAB法提取DNA效果比較好，可以完成DNA提取，快速、簡易、低成本，去除了蛋白質(zhì)、糖、酚類等雜質(zhì)，能夠滿足SRAP體系對(duì)模板的要求。

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)基于PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增譜帶雖較RAPD標(biāo)記穩(wěn)定，但同樣受反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序變化以及物種不同的影響，DNA模板質(zhì)量，不同廠家生產(chǎn)的Tap酶，PCR反應(yīng)的緩沖液以及各成分的濃度均能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用不同的體系組合對(duì)煙草的SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響很大，因此，有必要根據(jù)具體情況優(yōu)化反應(yīng)體系。SRAP體系優(yōu)化的方法有多種，一般均采用多次單因素設(shè)計(jì)的方法。本試驗(yàn)在簡化正交設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，得出了煙草SRAP最佳反應(yīng)體系(20uL)：Mg2+1.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L，引物0.2umol/L、Tap聚合酶1.5U、DNA模板40ng。

PCR擴(kuò)增還跟退火溫度密切相關(guān)，引物不同，其退火溫度也不同[11，12]。溫度高，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性強(qiáng)，溫度低，擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量高。本研究的擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，前5個(gè)循環(huán)程序?yàn)椋?4℃，1min，35℃，1min，72℃，2min，隨后的35個(gè)循環(huán)為：94℃，1min，53℃，1min，72℃，2min；最后72℃延伸5min，4℃保持。

3.2 SRAP正反交F1差異鑒定

SRAP作為一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，具有簡便、高共顯性、重復(fù)性好、條帶分離清晰等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于物種內(nèi)部系統(tǒng)樹的構(gòu)建、親緣關(guān)系的確定等，顯示了比較好的作用。本研究將SRAP應(yīng)用于4×4完全雙列雜交的基因組差異分析，SRAP擴(kuò)增效果良好，產(chǎn)率中等，條帶清晰，可以在煙草中產(chǎn)生多態(tài)，但是品種間的多態(tài)性條帶很少，100對(duì)引物組合中只有me3-em2、me4-em6、me6-em5、me10-em7等4個(gè)引物組合能擴(kuò)增出差異條帶，但正反交F1之間沒有擴(kuò)增出特異條帶。表明SRAP標(biāo)記在鑒別種內(nèi)之間的差異時(shí)效率不高。因?yàn)樵谵r(nóng)藝性狀和生理指標(biāo)中，親本與正反交F1的方差分析表明存在極顯著或者顯著差異。

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SRAP was used to compare differences of 4x4 Flue-cured Tobacco combinations by diallel crosses excluding reciprocal and identify reciprocal differences of Heredity. Amplified bands were only detected by me3-em2 prime pair、me4-em6 primer pair、me6-em5 primer pair and me10-em7 primer pair in the 100 primer pairs of 4x4 Flue-cured Tobacco combinations but specific bands were not amplified between Reciprocal Crosses Hybrids F1.The results showed that the efficiency of identification intraspecific differences was not high by SRAP.

Flue-cured tobacco SRAP Difference

國家煙草專賣局煙草育種重大專項(xiàng)[中煙辦〔2010〕221號(hào)]文合同編號(hào):110201002007。