楊樹(shù)林 楊 帆 翟 靜 劉金同 張 燕 陳 剛

孤獨(dú)癥(autism)是兒童廣泛性發(fā)育障礙(pervasive developmental disorder，PDD)的一種類(lèi)型，以三主征為主要表現(xiàn)，即言語(yǔ)發(fā)育障礙、人際交往障礙、興趣狹窄和行為方式刻板。發(fā)病后患者的社會(huì)能力將受到嚴(yán)重影響，有較高的致殘率，給社會(huì)和患者家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。近年的流行病學(xué)研究顯示，孤獨(dú)癥的患病率比以往有明顯增加，美國(guó)為4/10 000～10/10 000、歐洲為10/10 000、中國(guó)2.8/10 000 ～11/10 000，男女比例為(4 ～10)∶1［1，2］。本研究以山東省 38 個(gè)孤獨(dú)癥核心家系及正常對(duì)照者為研究對(duì)象，使用覆蓋4號(hào)染色體的22個(gè)微衛(wèi)星遺傳位點(diǎn)進(jìn)行了基因組掃描，并通過(guò)關(guān)聯(lián)分析尋找孤獨(dú)癥的相關(guān)性位點(diǎn)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 以國(guó)際疾病分類(lèi)10版(ICD-10)為診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇就診于山東省精神衛(wèi)生中心的孤獨(dú)癥核心家系，包括:患者38例，其中女性患者2例，男性患者36例，年齡為2～10歲，平均年齡(5.10±1.61)歲;患者父母75名，其中女性38名，男性37名;1 000名正常對(duì)照選自山東省血液中心的健康獻(xiàn)血者，女性570名，男性430名，年齡為 18～53歲，平均年齡(22.2±4.45)歲。本研究得到了山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，對(duì)受試者均進(jìn)行了知情告知。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備 采用酚-氯仿法提取外周血樣本中的基因組DNA。采用nanodrop 1000微量光度計(jì)測(cè)量DNA濃度，每個(gè)樣本測(cè)量?jī)纱危∑骄?。用無(wú)菌去離子水將樣品稀釋至20 ng/μl。

1.2.2 DNA混合池(DNA pooling)的構(gòu)建 每組每個(gè)樣品取10 μl DNA溶液混合，分別構(gòu)建患者組、對(duì)照組和患者父母組的DNA混合池?；旌铣谼NA終濃度為20 ng/μl。

1.2.3 遺傳位點(diǎn)的選擇 選擇針對(duì)4號(hào)染色體的Linkage Mapping Set2.5 套裝試劑盒(Applied Biosystem，美國(guó))，共22個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。引物的標(biāo)記熒光分別為綠色、藍(lán)色和黃色，分子量標(biāo)記熒光為橙色。

1.2.4 PCR反應(yīng) 使用Gene Amp 9700 DNA擴(kuò)增儀(Applied Biosystem，美國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系總體積為 15 μl，包括:DNA 模板 1.5 μl(20 ng/μl)，PrimeSTAR HS Premix(Takara)7.5 μl，等量正反向引物混合液 1 μl(5 μM)，無(wú)菌去離子水 5 μl。反應(yīng)程序?yàn)榻德涫絇CR(Touch Down PCR):94℃變性90 s，63℃退火90 s(每循環(huán)一次，退火溫度降低0.5℃)，72 ℃延伸90 s，14個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s，56℃退火90 s，72℃ 延伸90 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min;4℃保存。

1.2.5 毛細(xì)管凝膠電泳及基因分型 按照PCR產(chǎn)物熒光顏色和片段大小的不同，將PCR產(chǎn)物搭配組合進(jìn)行電泳觀察。患者組、對(duì)照組和患者父母組分別上樣，取混合后的 PCR 產(chǎn)物 4 μl與 9 μl上樣液(0.15 μl Liz 500，9 μl去離子甲酰胺)混合 ，加入96孔板中。95℃變性5 min，并迅速冰浴冷卻。使用ABI-3130(Applied Biosystem，美國(guó))毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行電泳觀察。試驗(yàn)數(shù)據(jù)由GeneMapper4.0軟件(Applied Biosystem，美國(guó))進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 樣品經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和基因分型后，即可得到等位基因圖譜(allele image pattern，AIP)。圖譜中峰的數(shù)量為遺傳位點(diǎn)上的等位基因數(shù)量，峰高則代表對(duì)應(yīng)等位基因的染色體數(shù)量。每個(gè)混合池中染色體的數(shù)量并不相等，相同位點(diǎn)兩組間的信號(hào)強(qiáng)度不可直接比較。所以，首先算出各等位基因占所有等位基因的比率，再乘以總?cè)旧w數(shù)，即可得到該等位基因在相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組中的染色體數(shù)量。以對(duì)照組為例，人類(lèi)為二倍體核型，1 000例對(duì)照組樣本在常染色體上的遺傳位點(diǎn)由2 000個(gè)等位基因組成，將某個(gè)等位基因的比率乘以2 000即可得到相應(yīng)等位基因在混合池中的染色體數(shù)量?；颊呓M與患者父母組使用相同方法計(jì)算。采用CLUMP軟件對(duì)患者組和對(duì)照組、患者組和患者父母組每個(gè)位點(diǎn)上的等位基因頻率進(jìn)行比較。兩組間基因頻率差異以P＜0.01作為有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

最終得到3個(gè)混合池樣本4號(hào)染色體上22個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因圖譜。根據(jù)圖譜計(jì)算各組位點(diǎn)中等位基因的染色體數(shù)量，采用CLUMP軟件統(tǒng)計(jì)比較各組間等位基因頻率的差異(見(jiàn)表1)。發(fā)現(xiàn)患者組與患者父母組的等位基因頻率在D4S392(4q13.3)位點(diǎn)有顯著性差異(P＜0.01);患者組與對(duì)照組的等位基因頻率在D4S1535(4q35.1)位點(diǎn)有顯著性差異(P＜0.01)。進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得到一致性驗(yàn)證，確認(rèn)此位點(diǎn)與孤獨(dú)癥呈現(xiàn)關(guān)聯(lián)。與孤獨(dú)癥相關(guān)聯(lián)的D4S392(4q13.3)位點(diǎn)和 D4S1535(4q35.1)位點(diǎn)的等位基因圖譜見(jiàn)圖1和圖2。

表1 孤獨(dú)癥患者組、患者父母組與對(duì)照組的4號(hào)染色體微衛(wèi)星位點(diǎn)掃描關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

圖1 孤獨(dú)癥患者組、患者父母組與對(duì)照組的D4S392位點(diǎn)基因掃描圖

圖2 孤獨(dú)癥患者組、患者父母組與對(duì)照組的D4S1535位點(diǎn)基因掃描圖

3 討論

孤獨(dú)癥屬于多基因遺傳病，有較高的遺傳異質(zhì)性，遺傳因素在孤獨(dú)癥的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，其遺傳度約為91%［2，3］。關(guān)聯(lián)與連鎖分析被較多地用于孤獨(dú)癥易感基因的研究。孤獨(dú)癥的分子遺傳學(xué)研究中也常以孤獨(dú)癥譜系疾病(autism spectrum disorder，ASD)和廣義孤獨(dú)癥(broad autism phenotype)作為研究對(duì)象。近20年來(lái)，國(guó)際上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些孤獨(dú)癥遺傳位點(diǎn)。其中已確定與孤獨(dú)癥連鎖的遺傳位點(diǎn)和基因有24個(gè)，分別是 7q22(AUTS1)、13q14(AUTS3)、15q11(AUTS4)、2q(AUTS5)、17q11(AUTS6)、17q21(AUTS7)、3q25-q27(AUTS8)、7q31(AUTS9)、7q36(AUTS10)、1q41(AUTS11)、21p13-q11(AUTS12)、12q14(AUTS13)、16p11.2(AUTS14A 、AUTS14B)、CNTNAP2基因(AUTS15)、SLC9A9基因(AUTS16)、SHANK2基因 (AUTS17)、CHD8 基因 (AUTS18)、NLGN3基因(AUTSX1)、NLGN4 基因(AUTSX2)、MECP2 基因(AUTSX3)、Xp22.11(AUTSX4)、RPL10基因(AUTSX5)和TMLHE基因(AUTSX6)。

迄今，對(duì)4號(hào)染色體與孤獨(dú)癥之間的相關(guān)性也進(jìn)行了一系列的關(guān)聯(lián)與連鎖分析。Schellenberg等［4］以微衛(wèi)星為遺傳學(xué)標(biāo)記對(duì)孤獨(dú)癥患者進(jìn)行了全基因組掃描研究，通過(guò)連鎖不平衡分析，在有女性患者的家系中發(fā)現(xiàn)4號(hào)染色體上存在易感位點(diǎn)。Field等［5］在對(duì)有閱讀障礙患者家系的關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)4q13.1、7q36.1-q36.2、7q36.3、16p12.1 和17q22 五個(gè)位點(diǎn)的 lod 值大于2.3，與疾病存在關(guān)聯(lián)。其中4q13.1位點(diǎn)與兒童多動(dòng)癥存在關(guān)聯(lián)，7q36.1-q36.2、7q36.3、16p12.1 和17q22位點(diǎn)與孤獨(dú)癥存在關(guān)聯(lián)。Zuo等［6］發(fā)現(xiàn)4號(hào)染色體上的ADH基因是非洲裔美國(guó)人精神分裂癥和歐洲裔美國(guó)人孤獨(dú)癥的危險(xiǎn)因素。但是，Auranen等［7］對(duì)芬蘭隔離人群中的孤獨(dú)癥復(fù)雜家系進(jìn)行了配對(duì)連鎖分析和同胞對(duì)分析中并未發(fā)現(xiàn)4號(hào)染色體上存在孤獨(dú)癥的易感性位點(diǎn)。

核型分析是遺傳性疾病病因研究的重要方法。人們發(fā)現(xiàn)染色體的異位、倒位、缺失和重迭在孤獨(dú)癥的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)也是尋找孤獨(dú)癥易感基因的重要途徑。Sabaratnam M等［8］報(bào)道了一例有dup(4)p12-p13染色體畸變的18歲女性孤獨(dú)癥患者。Ramanathan S等［9］報(bào)道了一例有 46，XY del 4(q31.3-q33)染色體畸變的孤獨(dú)癥患者，他們又通過(guò)分子遺傳學(xué)的研究方法發(fā)現(xiàn)該患者存在AMPA2基因，GLRA3基因，GLRB基因，NPY1R基因和NPY5R基因的半合子狀態(tài)，這些基因在學(xué)習(xí)、記憶能力和某些神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)中起到重要作用。Vincent JB等［10］報(bào)道了兩個(gè)有46，XY，inv(4)(p12-p15.3)染色體畸變的孤獨(dú)癥同胞，這個(gè)畸變可能影響到了γ-氨基丁酸受體基因家族，并由此引發(fā)孤獨(dú)癥。為了驗(yàn)證γ-氨基丁酸系統(tǒng)對(duì)孤獨(dú)癥的影響，Collins AL等［11］以高加索人種和非洲裔美國(guó)人種的孤獨(dú)癥復(fù)雜家系進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)35個(gè)SNP位點(diǎn)的篩查，他們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)人種在GABRB1基因和GABRA4基因中均存在陽(yáng)性位點(diǎn)。Chien WH 等［12］報(bào)道了兩個(gè)在 4q35.1-35.2 區(qū)域和8p23.2-pter分別存在 6.8 Mb 和 2.4 Mb 缺失的男性孤獨(dú)癥患者，而且這種染色體畸變?cè)谄渌颊吆驼?duì)照人群中均未被發(fā)現(xiàn)。Shimada S等［13］報(bào)道了一例有智力障礙和孤獨(dú)癥癥狀的塞-科二氏綜合征的患者，通過(guò)染色體表型分析，發(fā)現(xiàn)該患者在4q13.2和7p21.1區(qū)域同時(shí)存在缺失。與同樣存在7p21.1區(qū)域缺失的此類(lèi)患者相比，該患者的精神癥狀較重，所以4q13.2區(qū)域的缺失可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因。

此外，其他研究方法也表明4號(hào)染色體上存在孤獨(dú)癥的易感位點(diǎn)。三堿基重復(fù)序列在人類(lèi)DNA中廣泛存在，如CCG等，研究表明這些重復(fù)序列的變化可以影響某些疾病的遺傳易感性，如雙向情感障礙、精神分裂癥、孤獨(dú)癥和焦慮癥。Kleiderlein JJ等［14］通過(guò)cDNA探針發(fā)現(xiàn)4q35區(qū)域就存在這種重復(fù)序列。在DNA拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)的研究中，Gau SS等［15］報(bào)道了一例孤獨(dú)癥患者在 4q12-13.1和5q32區(qū)域存在分別為4.5 Mb和1.8 Mb的CNVs，這兩處變異分別來(lái)自無(wú)任何孤獨(dú)癥癥狀的患者母親和父親，所以可能是這兩處變異的綜合效應(yīng)導(dǎo)致了孤獨(dú)癥的發(fā)生。

在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)患者組與對(duì)照組的等位基因頻率在D7S513(7p21.3)位點(diǎn)有顯著性差異(P＜0.01)［16］。此次對(duì)4 號(hào)染色體的研究中，我們發(fā)現(xiàn)患者組與患者父母組的等位基因頻率在D4S392位點(diǎn)(4q13.3)有顯著性差異(P ＜0.01);患者組與對(duì)照組的等位基因頻率在D4S1535位點(diǎn)(4q35.1)有顯著性差異(P＜0.01)。這兩個(gè)位點(diǎn)與孤獨(dú)癥的相關(guān)性在我國(guó)也是首次報(bào)道。我們計(jì)劃在 D4S392和D4S1535附近挑選基因，選擇SNP等高密度遺傳標(biāo)記，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析、構(gòu)建單倍體型等方法，進(jìn)一步篩選孤獨(dú)癥的易感基因。

［1］Folstein SE，Rosen-Sheidley B.Genetics of autism:complex aetiology for a heterogeneous disorder［J］.Nat Rev Genet，2001，2(12):943-955

［2］楊樹(shù)林，陳剛.孤獨(dú)癥遺傳學(xué)研究進(jìn)展［J］.精神醫(yī)學(xué)雜志，2009，22(1):60-65

［3］Bailey A，Le Couteur A，Gottesman I，et al.Autism as a strongly genetic disorder:evidence from a British twin study［J］.Psychol Med，1995，25(1):63-77

［4］Schellenberg GD，Dawson G，Sung YJ，et al.Evidence for multiple loci from a genome scan of autism kindred［J］.Mol Psychiatry，2006，11(11):979，1049-1060

［5］Field LL，Shumansky K，Ryan J，et al.Dense-map genome scan for dyslexia supports loci at 4q13，16p12，17q22;suggests novel locus at 7q36［J］.Genes Brain Behav，2013，12(1):56-69

［6］Zuo L，Wang K，Zhang XY，et al.Association between common alcohol dehydrogenase gene(ADH)variants and schizophrenia and autism［J］.Hum Genet，2013，132(7):735-743

［7］Auranen M，Nieminen T，Majuri S，et al.Analysis of autism susceptibility gene loci on chromosomes 1p，4p，6q，7q，13q，15q，16p，17q，19q and 22q in Finnish multiplex families［J］.Mol Psychiatry，2000，5(3):320-322

［8］Sabaratnam M，Turk J，Vroegop P.Case report:autistic disorder and chromosomal abnormality 46，XX duplication(4)p12-p13［J］.Eur Child Adolesc Psychiatry，2000，9(4):307-311

［9］Ramanathan S，Woodroffe A，F(xiàn)lodman PL，et al.A case of autism with an interstitialdeletion on 4q leadingto hemizygosity for genes encoding for glutamine and glycine neurotransmitter receptor sub-units(AMPA 2，GLRA3，GLRB)and neuropeptide receptors NPY1R，NPY5R［J］.BMC Med Genet，2004，5:10

［10］Vincent JB，Horike SI，Choufani S，et al.An inversion inv(4)(p12-p15.3)in autistic siblings implicates the 4p GABA receptor gene cluster［J］.J Med Genet，2006，43(5):429-434

［11］Collins AL，Ma D，Whitehead PL，et al.Investigation of autism and GABA receptor subunit genes in multiple ethnic groups［J］.Neurogenetics，2006，7(3):167-174

［12］Chien WH，Gau SS，Wu YY，et al.Identification and molecularcharacterization oftwo novelchromosomal deletions associated with autism［J］.Clin Genet，2010，78(5):449-456

［13］Shimada S，Okamoto N，Nomura S，et al.Microdeletions of 5.5 Mb(4q13.2-q13.3)and 4.1 Mb(7p15.3-p21.1)associated with a saethre-chotzen-like phenotype，severe intellectual disability，and autism［J］.Am J Med Genet A，2013，161(8):2078-2083

［14］Kleiderlein JJ，Nisson PE，Jessee J，et al.CCG repeats in cDNAs from human brain［J］.Hum Genet，1998，103(6):666-673

［15］Gau SS，Liao HM，Hong CC，et al.Identification of two inherited copy number variants in a male with autism supports two-hit and compound heterozygosity models of autism［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2012，159B(6):710-717

［16］楊樹(shù)林，陳剛，翟靜.山東省孤獨(dú)癥7號(hào)染色體基因掃描研究［J］.精神醫(yī)學(xué)雜志，2009，22(1):1-4