鄒明新 姜樹原 張姝 閆少春 邵國(guó) 劉曉光

1.包頭師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030；

2.包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060

DNA甲基化在基因沉默，染色體重塑和基因組的穩(wěn)定中有重要作用。異常的DNA甲基化是疾病發(fā)生的一個(gè)重要因素。催化D N A 發(fā)生甲基化的酶為D N A 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)，DNMT主要有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，其中DNMT3B有近40種異構(gòu)體［1］。DNMT3B4是DNMT3B的一種異構(gòu)體，與全長(zhǎng)的DNMT3B1相比，缺少外顯子10、22和23，由于22和外顯子23編碼保守模序Ⅸ和Ⅹ，因此DNMT3B4缺少模序Ⅸ和Ⅹ［2］。由于DNMT3B的甲基轉(zhuǎn)移活性由保守模序Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅸ和Ⅹ組成，所以DNMT3B4應(yīng)該缺乏DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。

多種癌癥都存在DNA甲基化異常的情況，癌癥的一個(gè)重要特征是癌細(xì)胞基因組甲基化降低和抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)局部的甲基化升高［3］。在多種癌癥中都存在DNMT3B4表達(dá)異常的現(xiàn)象［2，4］。過表達(dá)DNMT3B4可以引起人上皮細(xì)胞衛(wèi)星DNA去甲基化，有研究報(bào)道，過表達(dá)DNMT3B4在50 d時(shí)可以使細(xì)胞增殖速度加快［5］，但并沒有引起等位基因的不平衡的發(fā)生［2］。因此，長(zhǎng)時(shí)間的過表達(dá)DNMT3B4對(duì)細(xì)胞周期的影響尚不清楚，本研究擬探討長(zhǎng)時(shí)間(300 d)過表達(dá)DNMT3B4對(duì)人胚腎細(xì)胞株293A細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)觀察其與細(xì)胞周期密切相關(guān)蛋白p21的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及載體

293A細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。pCMVDNMT3B4由本室構(gòu)建。

1.2 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司，無支原體新生牛血清購自杭州四季青生物工程公司，F(xiàn)ugene HD轉(zhuǎn)染試劑盒購自Roche公司，G418和MTT購自Sigma公司，superscript Ⅲ購自Invitrogen公司，2×real-time PCR Mix購自南京凱基公司，兔源DNMT3B多克隆抗體購自Santa Cruz公司，兔源p21多克隆抗體購自Upstate公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

293A細(xì)胞于含10%新生牛血清的RPMI-1 6 4 0 培養(yǎng)基，3 7 ℃、C O2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞增殖至8 0%時(shí)，按R o c h e 公 司F U G E N E H D 轉(zhuǎn) 染 程 序，將 質(zhì)粒pCMV-DNMT3B4轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，同時(shí)采用空質(zhì)粒pCMV-2B轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照，用700 μg/mL的G418篩選。篩選2周后挑選單克隆細(xì)胞通過real-time PCR鑒定是否為穩(wěn)定表達(dá)的克隆株，將穩(wěn)定表達(dá)的克隆株于350 μg/mL的G418維持培養(yǎng)300 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的real-time PCR檢測(cè)

TRIzol提取細(xì)胞總RNA，按superscript Ⅲ方法合成c D N A 第1 鏈。根據(jù)G e n B a n k序列，用P r i m e r p r e m i e r 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)DNMT3B，p21及內(nèi)參β-actin基因的引物。引物由Invitrogen公司合成，引物序列DNMT3B順義鏈：5’-AGGGAAGACTCGAT CCTCGTC-3’；DNMT3B反義鏈：5’-GTGT GTAGCTTAGCAGACTGG-3’；p21順義鏈：5’-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3’；p21反義鏈：5’-AAAGTCGAAGTTCCAT CGCTC-3’；β-actin順義鏈：5’-AGGTGAAG GTCGGAGTCA-3’；β-actin反義鏈：5’-GGTC ATTGATGGCAACAA-3’。Real-time PCR：使用ABI的96孔板，每孔依次加入cDNA 1 μL，2×mix 12.5 μL，3’和5’端引物(5 μmol/L)各1 μL，無菌水9.5 μL，在ABI 7900 real-time PCR反應(yīng)儀上反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min，再進(jìn)行92 ℃，30 s；54.5 ℃，35 s；72 ℃，30 s (40 cycles)，最后72 ℃延伸5 min停止反應(yīng)。

1.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白印跡法(Western blot檢測(cè))

用RIAP緩沖液裂解細(xì)胞，用BCA試劑測(cè)定蛋白含量，加上樣緩沖液調(diào)到各組蛋白量一致，10% SDS-PAGE，壓縮膠20 mA，分離膠30 mA，電泳后400 mA轉(zhuǎn)移至PVDF膜，預(yù)染蛋白marker確定蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)位置。用含10%脫脂奶粉TTBS液封閉，TTBS洗3次，每次10 min；加入1抗，4 ℃溫浴過夜，TTBS洗3次，每次10 min；1∶10 000加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗，37 ℃溫浴1 h，TTBS洗3次，每次10 min；用Pierce公司的ECL試劑盒進(jìn)行熒光顯色反應(yīng)。暗室中曝光、顯影、定影。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

調(diào)節(jié)細(xì)胞至每孔5×103接種入96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后開始檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)4 d，每天隨機(jī)選3個(gè)孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)3 h，去上清液后加入150 μL DMSO振蕩10 min后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)，以490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值代表細(xì)胞活力，以培養(yǎng)天數(shù)(d)為橫坐標(biāo)，以A值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

將細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到75%~80%時(shí)用磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌2次，然后細(xì)胞用0.5 mL的PBS懸浮，用4.5 mL的70%乙醇固定過夜。離心收集細(xì)胞并用0.2 mg/mL的propidium iodide (PI)、0.1%的Triton X-100和0.1 mg/mL RNase A室溫避光處理30 min，用FACScan流式細(xì)胞儀分析DNA含量，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞，測(cè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞周期的分布用ModFit 3.0程序分析。

1.8 甲基化特異PCR(MS-PCR)檢測(cè)p21基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)

使用康為公司基因組提取試劑盒從過表達(dá)D N M T 3 B 4 細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞提取基因組DNA，依照Zymo research的EZ DNA Methylation-Gold?Kit方法將2 μg基因組DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)換。p21基因啟動(dòng)子的MS-PCR有兩套引物對(duì)甲基化的DNA進(jìn)行研究(methylated MS-PCR和unmethylated MS-PCR)。p21甲基化引物順義鏈：5’-TA C G C G A G G T TTCGGGATCG-3’；p21甲基化引物反義鏈：AAAACGACCCGCGCTCG-3’；p21非甲基化引物順義鏈：TAT G T G A G G T T TTGGGATTGG-3’；p21非甲基化引物反義鏈：AAAAACAACCCACACTCAACC-3’［6］。20 μL反應(yīng)體系中包括：100 ng亞硫酸氫鹽處理的DNA，10 μL 2×PCR mix(TaKaRa)和特異引物(0.2 μmol/L)。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性60 s，61℃復(fù)性60 s，72 ℃延伸60 s，共35循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。9 μL的PCR產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，通過溴化乙錠(ethidium bromide)染色觀察結(jié)果，甲基化和非甲基化p21基因啟動(dòng)子區(qū)的產(chǎn)物為133 bp［6］。

1.9 數(shù)據(jù)處理

Real-time檢測(cè)中DNMT3B的CT值通過β-actin的CT值均一化，即ΔCT=CTDNMT?CTβactin，而DNMT3B mRNA相對(duì)豐度值以ΔΔCT值(DD value)表示，ΔΔCT=2?ΔCT。用Bandscan分析軟件對(duì)Western Blot結(jié)果圖像作半定量分析，Western blot結(jié)果以DNMT3B4條帶光密度值/β-actin條帶光密度值計(jì)算。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 10.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA和Tukey對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，數(shù)值以±s 表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高表達(dá)DNMT3B4的293A 細(xì)胞系的建立

與轉(zhuǎn)染空載體p C M V-2 B 的2 9 3 A 細(xì)胞(293A-vector)相比，轉(zhuǎn)染pCMV-DNMT3B4的2株高表達(dá)DNMT3B4的細(xì)胞(293A-DNMT3B4-1和293A-DNMT3B4-2)在mRNA及蛋白水平上都表達(dá)升高，D N M T 3 B 4 m R N A 在293A-DNMT3B4-1和293A-DNMT3B4-2中表達(dá)增加近(77.0±1.3)倍和(61.0±1.8)倍(P=0.008 3和P=0.009 5，圖1A)。在293A-vector中檢測(cè)不到DNMT3B4蛋白，而293A-DNMT3B4-1和293A-DNMT3B4-2則可見明顯的DNMT3B4蛋白條帶(圖1B)。

圖1 pCMV-2B和pCMV-DNMT3B4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293A細(xì)胞Fig.1 pCMV-2B and pCMV-DNMT3B4 were stable transfected into 293A cells

2.2 DNMT3B4對(duì)293A細(xì)胞增殖的影響

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株培養(yǎng)300 d后，在接種于96孔板的第4天內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，結(jié)果293A-DNMT3B4-1和293A-DNMT3B4-2的A值分別是293A-vector的(58.92±3.47)%和(68.82±5.64)%(P=0.004 9和P=0.007 8，圖2)。提示長(zhǎng)時(shí)間過表達(dá)DNMT3B4的293A細(xì)胞增殖能力明顯降低。

圖2 MTT法分析DNMT3B4過表達(dá)293A細(xì)胞增殖Fig.2 MTT analysis of the proliferation of DNMT3B4 overexpression cells

2.3 DNMT3B4對(duì)293A細(xì)胞周期的影響

用流式細(xì)胞儀分析PI染色的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，293A-DNMT3B4-1和293A-DNMT3B4-2的S期細(xì)胞比例分別為(35.88±2.00)%和(37.00±1.79)%，而293A-vector為(40.44±0.91)%，過表達(dá)DNMT3B4使S期細(xì)胞比例下降(P=0.029和P=0.036，圖3)。

2.4 DNMT3B4對(duì)293A細(xì)胞p21表達(dá)的影響

使用real-time PCR對(duì)p21的mRNA水平進(jìn)行分析，p21 mRNA的相對(duì)豐度值用p21 mRNA與β-actin mRNA的比值表示，293A-vector的相對(duì)度值為0.06±0.01，293A-DNMT3B4-1和293A-DNMT3B4-2的相對(duì)豐度值分別為0.42±0.14和0.40±0.11，較293A-vector增高了6.77和6.45倍，過表達(dá)DNMT3B4增高p21 mRNA水平(P=0.038和P=0.044，圖4A)。

使用Western blot對(duì)p21蛋白水平進(jìn)行分析，相對(duì)分子質(zhì)量為21×103的條帶在各株細(xì)胞都可以檢測(cè)到(圖4B)，以p21條帶的A值與β-actin條帶的A的比值代表p21蛋白的相對(duì)豐度，293A-vector的p21蛋白相對(duì)豐度值為0.15±0.03，293A-DNMT3B4-1和293A-DNMT3B4-2的分別為0.37±0.08和0.38±0.09，過表達(dá) DNMT3B4使293A細(xì)胞p21蛋白增加2倍以上(P=0.041和P=0.047，圖4C)。

2.5 DNMT3B4 對(duì)293A細(xì)胞p21基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響

使用MS-PCR技術(shù)對(duì)2株過表達(dá)DNMT3B4的293A細(xì)胞和293A-vector細(xì)胞的p21基因啟動(dòng)子的甲基化和非甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，過表達(dá)DNMT3B4的293A細(xì)胞和293A-vector細(xì)胞p21基因啟動(dòng)子區(qū)均為甲基化狀態(tài)，過表達(dá)DNMTD3B4沒有改變p21基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)(圖5)。

圖3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期進(jìn)程Fig.3 FACScan fl ow cytometer analysis of the cell cycle progress

圖4 p21在DNMT3B4過表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 p21 expression in DNMT3B4 overexpression cells

圖5 p21的MS-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of MS-PCR products for p21 in agarose gel

3 討 論

DNMT3B4過表達(dá)可以改變細(xì)胞的增殖情況，3BKO細(xì)胞過表達(dá)DNMT3B3Δ5可以提高克隆形成率［1］。Saito等［2］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染DNMT3B4后細(xì)胞的增殖率增加將近一倍。而在本研究中，過表達(dá)DNMT3B4的293A細(xì)胞增殖率為293-vector的60%~70%。Saito等［2］誘導(dǎo)DNMT3B4表達(dá)50 d來研究其增殖情況，這時(shí)細(xì)胞等位基因不平衡的現(xiàn)象還沒有出現(xiàn)，而本研究中穩(wěn)定表達(dá)DNMT3B4的293A細(xì)胞表達(dá)DNMT3B4長(zhǎng)達(dá)300 d左右。DNMT3B4過表達(dá)的時(shí)間不同可能是兩項(xiàng)研究結(jié)果差異的原因。

Saito等［2］研究發(fā)現(xiàn)將DNMT3B4過表達(dá)于293A細(xì)胞中，過表達(dá)50 d后會(huì)使衛(wèi)星DNA 2出現(xiàn)低甲基化的情況，而衛(wèi)星DNA 2的低甲基化是染色體不穩(wěn)定的重要原因。在復(fù)制過程中，過量的DNMT3B4蛋白可能在新合成的DNA鏈屏蔽DNMT1獲得CpG二核苷酸［7］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)DNMT3B4會(huì)使293A細(xì)胞的增殖受到抑制，主要原因可能是過表達(dá)DNMT3B4使其他有活性的DNMT3B的異構(gòu)體與DNMT3A結(jié)合的機(jī)會(huì)減少，這將導(dǎo)致DNA甲基化的從頭合成受到抑制。同時(shí)，過表達(dá)DNMT3B4使DNMT1結(jié)合CpG二核苷酸受到屏蔽，使DNA維持甲基化的受到抑制［7］。由于DNA甲基化的從頭合成和維持合成都受到了抑制，使細(xì)胞的增殖受到了抑制。

DNMTs與p21的表達(dá)關(guān)系密切［8-9］。p21是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的一種細(xì)胞周期素激酶的抑制劑，上調(diào)p21抑制細(xì)胞增殖［10］，p21可以通過抑制細(xì)胞周期素激酶和增殖核抗原(PCNA)來誘導(dǎo)G1期阻滯導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入不了S期［11］。本研究顯示過表達(dá)DNMT3B4誘導(dǎo)p21表達(dá)增加，但這種誘導(dǎo)是不依賴于p21基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的改變來進(jìn)行的［12］。其原因可能是DNMT3B4過表達(dá)引起染色體不穩(wěn)定或DNA甲基化受阻，DNMTs抑制劑可以上調(diào)p21的表達(dá)原因也是如此［11］，其作用機(jī)制不是通過p21基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化變化，而可能是通過DNA damage/ATM/p53途徑來實(shí)現(xiàn)的［13］。

本研究探討了長(zhǎng)時(shí)間(3 0 0 d)過表達(dá)DNMT3B4對(duì)293A細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)探討了p21在其中的作用，由于p21的表達(dá)變化不是由于其基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的改變引起的，我們將進(jìn)一步使用諸如敲除p53基因等其他的方法來確定過表達(dá)DNMT3B4對(duì)293細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

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