徐近 秦毅 張波 吉順榮 許文彥 施思 劉江 虞先濬

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胰腺肝膽外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，胰腺腫瘤研究所，上海 200032

人類基因組計劃基本完成后，研究基因的表達調(diào)控成為了解腫瘤發(fā)生機制的關(guān)鍵問題之一。隨著研究的不斷深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)基因的表達不僅取決于基因本身，還取決于不改變基因序列的表觀遺傳修飾。異常的表觀遺傳修飾會使基因發(fā)生錯誤的表達，進而引起代謝模式的異常，甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。表觀遺傳修飾主要涉及DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA調(diào)控等方式。其中組蛋白修飾因為其修飾的多樣性，以及遺傳密碼的豐富性而備受關(guān)注，隨著組蛋白乙酰化抑制劑等在治療腫瘤患者的成功臨床應(yīng)用，組蛋白修飾逐漸成為腫瘤表觀遺傳學(xué)的研究重點［1-2］。

組蛋白賴氨酸去甲基化酶1(lysine specific demetylase1，LSD1)是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶，通過催化組蛋白賴氨酸的去甲基化過程參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)整進而影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［3］。LSD1通過異常的基因表達調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及代謝異常等方面發(fā)揮著重要的作用，是一個潛在的干預(yù)腫瘤惡性潛能的靶點［4-6］。腫瘤的代謝異常是近些年研究的熱點。新陳代謝是機體生命活動的基本特征，腫瘤的惡性潛能離不開代謝模式的轉(zhuǎn)變來為其提供物質(zhì)和能量，大量的研究證實干預(yù)腫瘤的代謝也是一個重要的干預(yù)靶點［7-9］。在腫瘤代謝的關(guān)鍵調(diào)控分子中，Sirtuins 或沉默信息調(diào)節(jié)蛋白(silencing information regulator 2，Sir2)類似酶家族蛋白，因其在能量代謝，細胞氧化應(yīng)激，以及細胞長壽和衰老方面的重要作用而成為腫瘤代謝異常的研究熱點分子。該家族中的分子去乙?；?(sirtuin3，SIRT3)，位于線粒體內(nèi)，是線粒體內(nèi)的腫瘤抑制因子，通過調(diào)控細胞內(nèi)的活性氧水平和糖代謝水平而發(fā)揮抑癌基因的功能。SIRT3在腫瘤細胞中的低表達或者缺失會激發(fā)腫瘤細胞的惡性潛能已經(jīng)成為共識，但是其低表達的分子機制還有待深入研究［10-13］。

本文通過RNA干擾(RAN interference，RNAi)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，CoIP)、染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)及啟動子活性分析實驗，研究PANC-1細胞中LSD1與SIRT3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系，并為深入研究LSD1與胰腺腫瘤代謝異常提供了重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

PANC-1細胞和HEK293T細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

LSD1和PGC-1α的蛋白編碼區(qū)域分別克隆至真核表達載體pCMV-C-FLAG和pCMV-CHA中，得到FLAG融合的LSD1和HA融合的PGC-1α。

1.3 CoIP實驗

FLAG-LSD1質(zhì)粒和HA-PGC-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC-1細胞48 h后，用預(yù)冷的PBS清洗細胞2次。用1 mL RIPA緩沖液［20 mmol/L Tris-HCl(pH為8.0)，1% NP40，150 mmol/L NaCl，10% Glycerol，Roche cocktail抑制劑］冰上裂解30 min，隨后超聲破碎3次 ，功率100 W，超聲5 s，間隙20 s。12 000 r/min離心10 min后，去離心后，將細胞上清液與偶聯(lián)了FLAG抗體的親和膠(Sigma公司)共同在4 ℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合4 h。用RIPA緩沖液洗滌6次后，用FLAG肽競爭性洗脫1 h。洗脫樣品與2XSDS-PAGE上樣緩沖液混合，100 ℃水浴5 min。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測

樣品與蛋白上樣緩沖液煮沸5 min，SDSPAGE電泳分離樣品。濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至Portran硝酸纖維素膜，用含有5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉1 h。一抗與膜共同溫育2 h至過夜。PBST洗膜3次，每次10 min，二抗與膜共同溫育1 h，再用PBST洗膜3次，ECL顯色。

1.5 免疫熒光檢測

將FLAG-LSD1質(zhì)粒和HA-PGC-1α質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至在玻片上培養(yǎng)的PANC-1細胞中，培養(yǎng)36 h，用PBS洗滌1次，3.7%的多聚甲醛固定10 min，PBST洗滌2次，每次5 min。0.5%的Triton-X100破膜10 min，隨后用PBST+1% BSA洗滌2次。PBST(1%)BSA封閉30 min。將一抗稀釋到PBST/BSA中，與玻片室溫溫育2 h或者4 ℃過夜，PBST/BSA洗滌3次，每次10 min，加二抗溫育1 h。PBST/BSA洗滌3次，每次5 min，加含有DAPI的封片劑封片，4 ℃避光保存。激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

1.6 ChIP實驗

ChIP實驗采用Millipore公司的ChIP試劑盒(EZ CHIP KIT)，所用的LSD1和PGC-1α抗體購自Abcam公司，檢測SIRT3基因啟動子區(qū)域的引物順義鏈：5′-TACGTCTACCTGGGCGCGCCGG-3′；反義鏈：5′-CAAGGAGTCCTCCGGACTCGC-3′。

1.7 LSD1基因敲除細胞株的構(gòu)建

構(gòu)建pLKO.1-shLSD1的慢病毒表達克隆用來穩(wěn)定表達針對LSD1的shRNA，21 bp的靶位點分別為CCACGAGTCAAACCTTTATTT 和CCAACAATTAGAAGCACCTTA。共轉(zhuǎn)pLKO.1-shLSD1、psPAX和pMD2.G至HEK293T細胞中，48 h后收集培養(yǎng)基上清液得到慢病毒顆粒。用慢病毒顆粒感染PANC-1細胞，并用嘌呤霉素進行抗性篩選，得到穩(wěn)定表達shLSD1的PANC-1細胞株。

1.8 實時熒光定量PCR

TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄采用Invitrogen公司的SuperScriptⅢ試劑盒，定量PCR采用TAKARA公司的試劑盒。針對LSD1的引物為LSD1順義鏈：5’-GCTCGGGGCTCTTATTCCTA-3’；LSD1反義鏈：5’-CCCAAAAACTGGTCTGCAAT-3’；針對SIRT3的引物為SIRT3順義鏈：5′-ACCCAGTGGCATTCCAGAC-3′；S I R T 3 反 義 鏈：5′-G G C T T G G G G T T G TGAAAGAAG-3′；內(nèi)參引物為β-actin順義鏈5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；β-actin反義鏈：5′-AGCACTGTGTTGGGTACAG-3’。

1.9 雙熒光素酶報告基因分析

SIRT3基因的啟動子克隆至載體pGL2-Basci中，得到pGL2-SIRT3克隆，轉(zhuǎn)染PANC-1細胞，分析PGC-1α以及LSD1對SIRT3基因啟動子活性的影響。試劑盒采用Promega公司的雙熒光素酶報告基因檢測系。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 干擾LSD1對PANC-1細胞中SIRT3表達的影響

設(shè)計針對LSD1的shRNA序列，構(gòu)建慢病毒表達載體，包裝慢病毒后，感染PANC-1細胞后，檢測LSD1的干擾效果以及干擾LSD1后SIRT3表達水平的變化。與對照細胞相比，兩條shRNA能夠有效地干擾LSD1表達，mRNA水平分別下調(diào)72%和57%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001和P=0.026)。同時在干擾LSD1表達的PANC-1細胞中，SIRT3的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，與對照細胞相比分別上調(diào)4.32和5.72倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028和P<0.001)。Western blot檢測結(jié)果顯示，在LSD1基因敲除的細胞中，SIRT3蛋白水平明顯上升(圖1)。

圖1 干擾LSD1對PANC-1細胞中SIRT3表達的影響Fig.1 Effect of LSD1 knock-down on the expression of SIRT3

2.2 LSD1與PGC-1α相互作用

在PANC-1細胞中轉(zhuǎn)染FLAG-LSD1和HAPGC-1α，通過CoIP的方法發(fā)現(xiàn)，LSD1與PGC-1α存在相互作用。在PANC-1細胞中，再次通過CoIP的方法，以LSD1的抗體進行免疫沉淀，在免疫沉淀產(chǎn)物中檢測PGC-1α，證實LSD1與PGC-1α存在內(nèi)源的相互作用。通過免疫熒光，發(fā)現(xiàn)LSD1與PGC-1α在細胞核內(nèi)存在共定位(圖2)。

2.3 LSD1與PGC-1α共定位于SIRT3基因的啟動子區(qū)域

采用LSD1抗體進行ChIP實驗，發(fā)現(xiàn)LSD1可以結(jié)合SIRT3基因的啟動子。進一步采用PGC-1α抗體進行ChIP實驗，發(fā)現(xiàn)PGC-1α也可以結(jié)合在SIRT3基因的啟動子上。在證實LSD1和PGC-1α可以結(jié)合在SIRT3基因的啟動子區(qū)域后，采用二次ChIP實驗，發(fā)現(xiàn)LSD1和PGC-1α可以共同結(jié)合在SIRT3基因的啟動子上(圖3)。

2.4 LSD1抑制PGC-1α對SIRT3啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控

PGC-1α是一個已知的調(diào)控SIRT3轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行啟動子活性分析發(fā)現(xiàn)，LSD1可以顯著抑制PGC-1α對于SIRT3基因啟動子的激活效應(yīng)，抑制效率為19.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。進而證實LSD1是PGC-1α的輔抑制子，可以抑制SIRT3基因的轉(zhuǎn)錄(圖4)。

圖2 LSD1與PGC-1α相互作用Fig.2 LSD1 interacted with PGC-1α

圖3 LSD1與PGC-1α共定位于SIRT3基因啟動子區(qū)域Fig.3 LSD1 and PGC-1α co-occupy the same chromatin region in SIRT3 promoter

3 討 論

LSD1的發(fā)現(xiàn)是表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的重要進展。LSD1可以結(jié)合在基因的染色質(zhì)區(qū)域，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)調(diào)控基因的表達，通過調(diào)控細胞增殖和分裂相關(guān)因子的表達影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展?；贚SD1在表觀遺傳調(diào)控方向的重要作用，其在腫瘤中的作用也逐漸得到重視。隨著腫瘤代謝異常與腫瘤惡性潛能的關(guān)系研究不斷深入，LSD1在腫瘤代謝方面的作用也逐漸引起關(guān)注［14-15］。

圖4 LSD1抑制PGC-1α對SIRT3啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控Fig.4 LSD1 inhibits PGC-1α transcriptional activity on SIRT3 expression

本研究發(fā)現(xiàn)，LSD1可以負向調(diào)控腫瘤代謝重要調(diào)控因子SIRT3的表達。細胞內(nèi)SIRT3的表達主要受到PGC-1α的調(diào)控，PGC-1α是核受體的輔因子，最早發(fā)現(xiàn)于1998年，在細胞的葡萄糖、脂肪酸以及線粒體的氧化應(yīng)激方面起著重要的作用，是治療肥胖、糖尿病等疾病的藥物靶點［16-17］。通過CoIP以及免疫熒光檢測蛋白共定位的實驗，我們在PANC-1細胞中驗證了LSD1與PGC-1α的相互作用，為揭示LSD1在胰腺癌中代謝異常方面的作用提供了重要依據(jù)。

綜上所述，LSD1可以與PGC-1α相互作用而調(diào)控重要代謝調(diào)控因子SIRT3的表達。本研究為研究腫瘤代謝表觀遺傳調(diào)控提供了新的思路，也為研究改善胰腺腫瘤代謝異常而抑制胰腺癌惡性潛能提供了新的分子靶標(biāo)。

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