曹明哲 陳舒怡

胚胎干細胞(embryonic stem cell,ES細胞)是從胚胎發(fā)育初期囊胚的內(nèi)細胞團（inner cell mass）分離出來，在體外培養(yǎng)形成的一類特殊的細胞。它們具有強大的增生能力，同時還具有形成機體所有類型細胞的巨大分化潛力。這兩個特性使得ES細胞從發(fā)現(xiàn)之初就成為醫(yī)學和生物學研究領(lǐng)域廣受青睞的細胞[1-5]。近年來，誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cell,iPS細胞）研究的飛速進展進一步推動了ES/iPS細胞的應(yīng)用前景[6-11]。眼睛是人類認知世界的窗口，正常視功能是人們進行日常生活不可或缺的感官功能,每天有成千上萬的人由于遺傳、生理或環(huán)境等因素失去視力，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。醫(yī)學的發(fā)展使得人類的平均壽命在不斷提高，隨之而來的是老年病發(fā)病率的不斷攀升，青光眼、色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)視網(wǎng)膜黃斑變性等視網(wǎng)膜退行性疾病在老年人群中尤其普遍，嚴重影響老年人群的生活質(zhì)量[12-13]。視網(wǎng)膜是人體再生能力很差的一類組織，成年機體無法自我更新那些病變中丟失的視網(wǎng)膜細胞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜退行性病變的不可逆性。因此，引入外源細胞替代丟失的視網(wǎng)膜神經(jīng)元成為恢復(fù)患者視覺的為數(shù)不多的潛在手段之一。此外，相對于血液系統(tǒng)、內(nèi)臟器官，眼睛的移植排斥反應(yīng)要弱得多。而且，眼科手術(shù)對全身干擾較小，并發(fā)癥相對輕微，這些優(yōu)點使得眼睛成為細胞替代治療嘗試的理想器官。要實現(xiàn)細胞替代治療，探索合適、充足的供體細胞來源是重要的第一步。近年來，人們在探索將ES/iPS細胞體外定向誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元，甚至整個視網(wǎng)膜方面已取得多項進展。在此篇綜述中，首先簡要概括哺乳動物視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)、發(fā)育過程和調(diào)控機制，然后，重點闡述近年來科研工作者探索ES/iPS細胞體外誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜細胞和組織的研究進展。

一、神經(jīng)視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和發(fā)育

哺乳動物的視網(wǎng)膜組織由神經(jīng)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮層兩大部分組成：視網(wǎng)膜色素上皮層是單層細胞結(jié)構(gòu)，主要對神經(jīng)視網(wǎng)膜起支持、營養(yǎng)和保護作用；神經(jīng)視網(wǎng)膜層由多層細胞構(gòu)成，是眼睛接收和初步處理光學信息的關(guān)鍵神經(jīng)組織。神經(jīng)視網(wǎng)膜層由七大類細胞構(gòu)成：視錐細胞、視桿細胞、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、Müller膠質(zhì)細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞。這七種細胞和它們的細胞連接有規(guī)律地排列形成三個細胞層和兩個神經(jīng)突觸層：感受光學信號的視錐和視桿兩種光感受器的細胞體形成最外面的外細胞核層（outer nuclear layer）；對光感受器傳來的光神經(jīng)信號進行初步處理的三種中間神經(jīng)元（水平細胞、雙極細胞和無長突細胞）以及起支持作用的Müller膠質(zhì)細胞的細胞體構(gòu)成內(nèi)細胞核層（inner nuclear layer）；最內(nèi)面靠近玻璃體的是神經(jīng)節(jié)細胞層（ganglion cell layer）；外細胞核層與內(nèi)細胞核層細胞之間的神經(jīng)突觸構(gòu)成外網(wǎng)層（outer plexiform layer）；內(nèi)細胞核層的中間神經(jīng)元與神經(jīng)節(jié)細胞之間的神經(jīng)突觸構(gòu)成內(nèi)網(wǎng)層（inner plexiform layer）。哺乳動物視網(wǎng)膜高度有序的組織排列從結(jié)構(gòu)上保障了光信號的有效接收、傳遞和處理。

從發(fā)育角度來看，復(fù)雜的視網(wǎng)膜組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)在身體頭部位置向兩側(cè)的延伸：在神經(jīng)胚芽階段，中腦部位的神經(jīng)管向兩側(cè)外伸，形成管狀結(jié)構(gòu)的視泡（optic vesicle）。當視泡接近胚胎表面外胚層的時候，組織遷移模式發(fā)生改變，開始向內(nèi)凹陷，形成雙層結(jié)構(gòu)的視杯（optic cup）。視杯的外層是視網(wǎng)膜色素細胞層，內(nèi)層是神經(jīng)視網(wǎng)膜層。在視杯內(nèi)凹的同時，與其相鄰的胚胎外胚層也相應(yīng)地向內(nèi)凹陷，形成晶狀體小泡（lens vesicle）。晶狀體小泡繼續(xù)內(nèi)凹并與表面外胚層脫離，最終將形成晶狀體，而晶狀體小泡脫離后剩下的胚胎外胚層將發(fā)育成角膜上皮。這樣，整個眼睛的大體結(jié)構(gòu)就確立起來[14-17]。在視杯階段，神經(jīng)視網(wǎng)膜層是由假復(fù)層結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜前體細胞組成。視網(wǎng)膜前體細胞增生快速，并具有分化為所有類別視網(wǎng)膜細胞的潛能。視網(wǎng)膜的六種神經(jīng)元與一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化是按照一定的時段順序進行的，但彼此的分化時段又有一定的重合：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞在各類哺乳動物中都是最先分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)元；接著是無長突細胞、水平細胞和視錐細胞；最后是視桿細胞、雙極細胞和Müller細胞?，F(xiàn)普遍接受的觀點認為，視網(wǎng)膜前體細胞在發(fā)育過程中逐步經(jīng)歷各種‘感受狀態(tài)（competent state）’階段。所謂的‘感受狀態(tài)’是指視網(wǎng)膜前體細胞可以接受環(huán)境信號刺激向某種細胞發(fā)育的狀態(tài)，也就是說，視杯發(fā)育早期的視網(wǎng)膜前體細胞只能被誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、無長突細胞等早期視網(wǎng)膜細胞，而視網(wǎng)膜發(fā)育晚期的前體細胞只能被誘導(dǎo)分化為視桿細胞、Müller細胞等晚期分化視網(wǎng)膜細胞。視網(wǎng)膜前體細胞的這種‘感受狀態(tài)’表明視網(wǎng)膜細胞的增生和分化是受內(nèi)源因素和外部環(huán)境共同調(diào)控的。各種遺傳學、細胞和分子生物學研究也證實視網(wǎng)膜前體細胞的增生與分化是受各種轉(zhuǎn)錄因子和信號傳導(dǎo)通路調(diào)控的[18-23]。對于視網(wǎng)膜發(fā)育基本過程和調(diào)控機制的深入了解有利于我們探尋眼科疾病的發(fā)病機制和治療新途徑（圖1）。

二、ES/iPS細胞體外誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜神經(jīng)元

圖1 視網(wǎng)膜發(fā)育過程

ES細胞具有強大的分化潛能：將小鼠ES細胞注射入早期胚胎中形成嵌合體，再將其移植入代孕母鼠子宮中后，ES細胞可以分化為包括視網(wǎng)膜組織在內(nèi)的各種組織和細胞。然而，若要在體外將ES細胞特異性地誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元，如何在體外模擬體內(nèi)視網(wǎng)膜細胞分化各階段的環(huán)境是解決問題的關(guān)鍵。最初，人們嘗試將ES細胞與胚胎發(fā)育階段的視網(wǎng)膜組織共培養(yǎng)以模擬體內(nèi)視網(wǎng)膜前體細胞分化環(huán)境[24-25]，或與間充質(zhì)細胞共培養(yǎng)[26]，或過表達視網(wǎng)膜前體細胞關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，期待激活細胞的視網(wǎng)膜細胞轉(zhuǎn)錄基因組活性[27]。然而，這些方法所得到的細胞雖然表達某些視網(wǎng)膜細胞特異性基因，但是細胞形態(tài)和功能等方面與體內(nèi)視網(wǎng)膜細胞相差很大。在人們探索誘導(dǎo)ES細胞向視網(wǎng)膜細胞分化的同時，多個研究組成功地在體外將ES細胞定向分化為神經(jīng)細胞[28-30]。這些實驗提示，在ES細胞分化初期抑制Wnt和Nodal信號通路可以促進神經(jīng)外胚層的發(fā)育。視網(wǎng)膜是神經(jīng)管在胚胎發(fā)育早期向兩側(cè)延伸繼續(xù)發(fā)育而形成的神經(jīng)組織。如果參照體內(nèi)神經(jīng)組織發(fā)育不同階段對信號通路的需求，將體外初步發(fā)育的神經(jīng)外胚層先向中腦組織命運狀態(tài)誘導(dǎo)，再進一步誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜細胞，有可能提高誘導(dǎo)分化效率。正是基于這樣的思路，Ikeda等[31]通過向懸浮培養(yǎng)的小鼠ES細胞聚集團添加Dkk1來抑制Wnt信號通路，LeftyA來抑制Nodal信號通路，將ES細胞誘導(dǎo)分化為Six3+的中腦細胞。隨后，他們再添加activin和血清，將Six3+中腦細胞繼續(xù)培養(yǎng)，終于獲得Rx+、Pax6+的視網(wǎng)膜前體細胞。如果將這些ES細胞分化而來的視網(wǎng)膜前體細胞與發(fā)育階段的視網(wǎng)膜組織共培養(yǎng)，這些細胞可以分化為各種視網(wǎng)膜細胞，證明他們的前體細胞特性。緊接著，用類似的方法，Lamba等[32]將人ES細胞在體外也成功誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜前體細胞。在人視網(wǎng)膜前體細胞的誘導(dǎo)方案中，LeftyA被Noggin取代來抑制BMP信號通路活性，另外IGF-1被用來激活胰島素樣信號通路。在這樣的培養(yǎng)條件下，人ES細胞表達視網(wǎng)膜前體細胞特異性基因，包括 ET、Rx、Six3、Pax6、Lhx2、Optx2、Chx10和Sox2。同時，有些細胞表達視網(wǎng)膜神經(jīng)元特異性蛋白，如無長突細胞特異性Hu C/D、神經(jīng)節(jié)細胞特異性NF-M、雙極細胞特異性α-PKC、光感受器特異性Crx、視錐細胞特異性S-Opsin、視桿細胞特異性Nrl和Rhodopsin。

雖然結(jié)合細胞聚集團懸浮培養(yǎng)，以及抑制Wnt和TGF-β信號通路可以有效地將ES細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜前體細胞，但是，在這些培養(yǎng)條件下，視網(wǎng)膜前體細胞分化為成熟視網(wǎng)膜細胞的效率非常低下。體外培養(yǎng)和小鼠遺傳學實驗都表明Notch信號通路抑制視網(wǎng)膜光感受器的發(fā)育[33-34]。為了提高ES細胞向光感受器分化的效率，Osakada等[35]對ES細胞向視網(wǎng)膜前體細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。他們將經(jīng)過Dkk1、LeftyA、activin和血清誘導(dǎo)分化的ES細胞通過細胞分選富集Rx+視網(wǎng)膜前體細胞，再添加DAPT來抑制Notch信號通路的活性。在DAPT的作用下，有20﹪的Rx+視網(wǎng)膜前體細胞分化為Crx+的光感受器前體細胞。如果將Crx+的光感受器前體細胞繼續(xù)培養(yǎng)，約一半的細胞發(fā)育為視錐細胞，但是視桿細胞的比率非常低。為了提高視桿細胞的分化效率，Osakada等[35]向培養(yǎng)體系中添加了retinoic acid、aFGF、bFGF、taurine 和Shh多種促進視桿細胞發(fā)育的因子。在這些因子的作用下，有近20﹪的細胞最終分化為Rhodopsin+的視桿細胞。采用相似的培養(yǎng)體系，人和猴子的ES細胞可以被誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜前體細胞和光感受器[35-36]。為了探索更適合臨床治療應(yīng)用的人視網(wǎng)膜光感受器細胞制備方法，Takahashi研究組嘗試用小分子化合物替代在細菌中合成的重組蛋白，來誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細胞分化。他們用Casein激酶抑制劑-CKI-7替代Dkk1抑制Wnt信號通路，用SB-431542替代LeftyA抑制Nodal通路，在光感受器細胞分化階段只保留retinoic acid和taurine兩種小分子。研究結(jié)果表明，CKI-7和SB-431542兩個小分子化合物完全可以取代Dkk1和LeftyA誘導(dǎo)視網(wǎng)膜前體細胞的分化。這種條件下得到的視網(wǎng)膜前體細胞在retinoic acid 和taurine的作用下也可以分化為光感受器細胞[37]。實際上，懸浮培養(yǎng)的ES細胞本身也會產(chǎn)生Dkk和Lefty，即使沒有外源的Wnt和Nodal抑制劑，一部份的ES細胞也可以沿著視網(wǎng)膜發(fā)育的進程向視網(wǎng)膜細胞命運發(fā)展[38]。

ES細胞以其多能性而廣受青睞，在體內(nèi)它可以形成整個機體，然而，在體外ES細胞的分化大多限于單個細胞個體。2011年，Sasai研究小組在原有的視網(wǎng)膜細胞誘導(dǎo)分化的結(jié)果基礎(chǔ)上，繼續(xù)摸索優(yōu)化培養(yǎng)條件，利用并不復(fù)雜的培養(yǎng)體系使小鼠ES細胞在體外自我組織形成了與體內(nèi)視網(wǎng)膜組織極其相似的組織，成為ES細胞體外分化研究的突破性進展。他們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)體系中添加細胞外基質(zhì)成分，如Matrigel、Laminin或entactin，可以顯著促進小鼠ES細胞向Rx+視網(wǎng)膜前體細胞分化。將這些Rx+細胞繼續(xù)培養(yǎng)，原本形態(tài)均一的ES細胞團開始形成中空并具極性的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。令人驚訝的是，如果繼續(xù)培養(yǎng)，中空的神經(jīng)上皮開始向內(nèi)凹陷形成與體內(nèi)胚胎發(fā)育期的視杯十分相似的組織構(gòu)造 ：外層是 Mitf+、Pax6+、Coup-TF2+的單層視網(wǎng)膜色素上皮細胞，內(nèi)層是增生活躍的Rx+、Pax6+、Six3+、Chx10+神經(jīng)視網(wǎng)膜前體細胞層。更加令人驚訝的是，如果將這些視杯樣組織分離出來繼續(xù)培養(yǎng)，視杯樣組織將發(fā)育成和新生小鼠的視網(wǎng)膜組織類似的包含有六種視網(wǎng)膜神經(jīng)元（視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、無軸突細胞、水平細胞、雙極細胞和兩種感光細胞）和Müller膠質(zhì)細胞，并且分層排列的組織結(jié)構(gòu)[39]。不久以后，同一個研究小組成功地證明人的ES細胞在體外同樣也可以自主組織形成視網(wǎng)膜組織[40]。人ES細胞體外自主形成視網(wǎng)膜組織的培養(yǎng)條件與小鼠ES細胞培養(yǎng)條件略有不同，形態(tài)發(fā)生進程不盡相同，所需時間也要長的多，這也顯示出物種差別也影響組織體外發(fā)育進程。

三、利用ES/iPS細胞治療視網(wǎng)膜疾病

英國的Ali研究組證明外源移植的視網(wǎng)膜細胞可以整合入小鼠視網(wǎng)膜組織中，分化為形態(tài)結(jié)構(gòu)完全正常的視桿細胞。他們的研究表明，選擇合適發(fā)育階段的供體細胞是移植成功的決定因素之一。對于視網(wǎng)膜感光細胞來說，只有已經(jīng)退出細胞周期但尚未終末分化的視桿前體細胞才能夠成功整合入視網(wǎng)膜外細胞核層并分化為成熟視桿細胞[41]。接著，他們證明這些移植的視桿細胞與受體小鼠的雙極細胞和水平細胞形成神經(jīng)突觸連接，能夠?qū)Π倒獯碳ば纬缮窠?jīng)電生理反應(yīng)，所形成的電生理信號能夠一直傳至大腦視覺中樞，形成視覺反射[42-43]。與視桿細胞類似，成功視錐細胞移植也需要選擇剛剛退出細胞周期的視錐前體細胞[44]。最近有研究表明，成熟的視桿細胞也可以被成功移植并整合入體內(nèi)視網(wǎng)膜外細胞核層中[45]，這大大擴展了可被移植的供體細胞范圍。光感受器移植實驗有力地證明細胞移植治療視網(wǎng)膜感光細胞退行性疾病的技術(shù)可行性。

如前所述，多個研究已實現(xiàn)在體外將人ES細胞高效定向誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜前體細胞，并能進一步形成視網(wǎng)膜光感受器。結(jié)合ES細胞體外培養(yǎng)技術(shù)、光感受器前體細胞移植技術(shù)，人們開始測試是否可以用ES細胞治療光感受器退行性疾病。出于倫理考慮，這些探索性實驗多是在正常小鼠或光感受器退行性病變模型小鼠中進行。Reh研究小組用他們之前發(fā)表的誘導(dǎo)方法[32]將人ES細胞在體外分化為視網(wǎng)膜細胞，然后移植入小鼠眼內(nèi)。如果進行玻璃體腔移植，體外分化的人視網(wǎng)膜細胞可以整合入小鼠視網(wǎng)膜各個細胞層中，并表達相應(yīng)層細胞的標志性基因，但光感受器的整合分化在這種移植方式下都比較低，如果移植入視網(wǎng)膜下腔，體外分化的人視網(wǎng)膜細胞大多整合入外細胞核層，并分化為成熟的光感受器細胞[46]。但奇怪的是，由小鼠ES細胞體外分化的光感受器細胞反而不能整合入小鼠視網(wǎng)膜組織中[47]。這兩個實驗結(jié)果的差異可能反映了物種的差異，也可能是由于體外培養(yǎng)方法或移植方式的差別造成的。但是，如果用體外3D培養(yǎng)的方法先培養(yǎng)出視網(wǎng)膜組織，再從培養(yǎng)視網(wǎng)膜組織中純化光感受器前體細胞，這樣獲得的小鼠細胞可以有效地整合入小鼠外細胞核層中[48]。異體細胞移植都會面臨免疫排斥反應(yīng)，人ES細胞來源十分有限，且存在倫理頸瓶。這兩方面的問題極大限制ES細胞替代治療應(yīng)用前景。Yamanaka研究組誘導(dǎo)多能干細胞（iPS）的開創(chuàng)性的研究成果緩解了困擾ES細胞研究的醫(yī)學倫理問題和移植免疫排斥問題[6-7]?，F(xiàn)在人們已經(jīng)能夠?qū)ㄑ?、?nèi)臟器官、神經(jīng)組織，甚至是尿液中提取的細胞誘導(dǎo)重編程為多能干細胞[8-11]，使得這項技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛。在人們探索出將ES細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜細胞或組織，以及光感受器移植治療視網(wǎng)膜退行性疾病的有效方案后，人們將這些研究成果也應(yīng)用于iPS細胞上，證實iPS細胞同樣可以被有效地誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜細胞和組織[36-38,49-51]，并用來治療視網(wǎng)膜退行性疾病[49,52]，這大大擴展了應(yīng)用ES/iPS細胞治療視網(wǎng)膜疾病的前景（圖2）。

四、總結(jié)

ES/iPS細胞由于其強大的增生和分化能力成為細胞替代療法的理想的供體細胞。通過長期的探索，現(xiàn)在人們已經(jīng)能夠?qū)S/iPS細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜細胞，甚至是整個視網(wǎng)膜組織?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)顯示由ES/iPS細胞體外形成的視網(wǎng)膜細胞具有細胞替代治療視網(wǎng)膜退行性疾病的潛力。然而，要實現(xiàn)ES/iPS細胞替代療法治療視網(wǎng)膜退行性疾病，仍有許多問題需要解決。例如，對于特定的視網(wǎng)膜細胞，體外誘導(dǎo)分化的效率仍有待提高，特別是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞至今仍缺乏高效誘導(dǎo)方案，雖然，光感受器細胞已可以被成功移植并整合入視網(wǎng)膜組織中，但人光感受器細胞的整合效率仍然低下，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的整合結(jié)果更加差強人意，ES/iPS細胞替代療法伴隨的風險是殘留的干細胞會導(dǎo)致眼內(nèi)腫瘤的發(fā)生，如何掌握體外分化時程，純化篩選視網(wǎng)膜細胞，監(jiān)測排除干細胞是實現(xiàn)臨床應(yīng)用必須考慮的問題。

圖2 ES/iPS細胞可以逐步誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜前體細胞，進而發(fā)育形成各種視網(wǎng)膜神經(jīng)元

1 Evans MJ ,Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature,1981,292(5819):154-156.

2 Martin GR.Isolation of pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1981,78(12):7634-7638.

3 Bradley A,Evans M, Kaufman MH,et al.Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines[J].Nature,1984,309(5965):255-256.

4 Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science,1998,282(5391):1145-1147.

5 Daley GQ.Prospects for stem cell therapeutics: myths and medicines[J].Curr Opin Genet Dev,2002,12(5):607-613.

6 Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

7 Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.

8 Hanna J,Markoulaki S,Schorderet P,et al.Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency[J].Cell,2008,133(2):250-264.

9 Aoi T,Yae K,Nakagawa M,et al.Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells[J].Science,2008,321(5889):699-702.

10 Stadtfeld M,Brennand K,Hochedlinger K.Reprogramming of pancreatic beta cells into induced pluripotent stem cells[J].Curr Biol,2008,18(12):890-894.

11 Kim JB,Zaehres H,Wu G,et al.Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors[J].Nature,2008,454(7204):646-650.

12 de Jong PT.Age-related macular degeneration[J].N Engl J Med,2006,355(14):1474-1485

13 Varma R,Lee PP,Goldberg I,et al.An assessment of the health and economic burdens of glaucoma[J].Am J Ophthalmol,2011,152(4):515-522.

14 Martinez-Morales JR,Wittbrodt J.Shaping the vertebrate eye[J].Curr Opin Genet Dev,2009,19(5):511-517.

15 Chow RL,Lang RA.Early eye development in vertebrates[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2001,17:255-296.

16 Adler R,Canto-Soler MV.Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities,ambiguities and controversies[J].Dev Biol,2007,305(1):1-13.

17 Fuhrmann S.Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle[J].Curr Top Dev Biol,2010,93:61-84.

18 Esteve P,Bovolenta P.Secreted inducers in vertebrate eye development: more functions for old morphogens[J].Curr Opin Neurobiol,2006,16(1):13-19.

19 Agathocleous M,Harris WA.From progenitors to differentiated cells in the vertebrate retina[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2009,25:45-69.

20 Cayouette M,Poggi L,Harris WA.Lineage in the vertebrate retina[J].Trends Neurosci,2006,29(10):563-570.

21 Cepko CL,Austin CP,Yang X,et al.Cell fate determination in the vertebrate retina[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1996,93(2):589-595.

22 Harada T,Harada C,Parada LF.Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye[J].Genes Dev,2007,21(4):367-378.

23 Xiang M.Intrinsic control of mammalian retinogenesis[J].Cell Mol Life Sci,2013,70(14):2519-2532.

24 Zhao X,Liu J,Ahmad I.Differentiation of embryonic stem cells into retinal neurons[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,297(2):177-184.

25 Sugie Y,Yoshikawa M,Ouji Y,et al.Photoreceptor cells from mouse ES cells by co-culture with chick embryonic retina[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,332(1):241-247.

26 Hirano M,Yamamoto A,Yoshimura N,et al.Generation of structures formed by lens and retinal cells differentiating from embryonic stem cells[J].Dev Dyn,2003,228(4):664-671.

27 Tabata Y,Ouchi Y,Kamiya H,et al.Specification of the retinal fate of mouse embryonic stem cells by ectopic expression of Rx/rax,a homeobox gene[J].Mol Cell Biol,2004,24(10):4513-4521.

28 Watanabe K,Kamiya D,Nishiyama A,et al.Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells[J].Nat Neurosci,2005,8(3):288-296.

29 Ying QL,Stavridis M,Griffiths D,et al.Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture[J].Nat Biotechnol,2003,21(2):183-186.

30 Aubert J,Dunstan H,Chambers I,et al.Functional gene screening in embryonic stem cells implicates Wnt antagonism in neural differentiation[J].Nat Biotechnol,2002,20(12):1240-1245.

31 Ikeda H,Osakada F,Watanabe K,et al.Generation of Rx+/Pax6+ neural retinal precursors from embryonic stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(32):11331-11336.

32 Lamba DA,Karl MO,Ware CB,et al.Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(34):12769-12774.

33 Yaron O,Farhy C,Marquardt T,et al.Notch1 functions to suppress cone-photoreceptor fate specification in the developing mouse retina[J].Development,2006,133(7):1367-1378.

34 Jadhav AP,Mason HA,Cepko CL.Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina[J].Development,2006,133(5):913-923.

35 Osakada F,Ikeda H,Mandai M,et al.Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse,monkey and human embryonic stem cells[J].Nat Biotechnol,2008,26(2):215-224.

36 Boucherie C,Mukherjee S,Henckaerts E,et al.Brief report:self-organizing neuroepithelium from human pluripotent stem cells facilitates derivation of photoreceptors[J].Stem Cells,2013,31(2):408-414.

37 Osakada F,Jin ZB,Hirami Y,et al.In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction[J].J Cell Sci,2009,122(17):3169-3179.

38 Meyer JS,Shearer RL,Capowski EE,et al.Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(39):16698-16703.

39 Eiraku M,Takata N,Ishibashi H,et al.Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture[J].Nature,2011,472(7341):51-56.

40 Nakano T,Ando S,Takata N,et al.Self-Formation of Optic Cups and Storable Stratified Neural Retina from Human ESCs[J].Cell Stem Cell,2012,10(6):771-785.

41 MacLaren RE,Pearson RA,MacNeil A,et al.Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors[J].Nature,2006,444(7116):203-207.

42 Pearson RA,Barber AC,Rizzi M,et al.Restoration of vision after transplantation of photoreceptors[J].Nature,2012,485(7396):99-103.

43 Barber AC,Hippert C,Duran Y,et al.Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(1):354-359.

44 Lakowski J,Baron M,Bainbridge J,et al.Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells[J].Hum Mol Genet,2010,19(23):4545-4559.

45 Gust J,Reh TA.Adult donor rod photoreceptors integrate into the mature mouse retina[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2011,52(8):5266-5272.

46 Lamba DA,Gust J,Reh TA.Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice[J].Cell Stem Cell,2009,4(1):73-79.

47 West EL,Gonzalez-Cordero A,Hippert C,et al.Defining the integration capacity of embryonic stem cell-derived photoreceptor precursors[J].Stem Cells,2012,30(7):1424-1435.

48 Gonzalez-Cordero A,West EL,Pearson RA,et al.Photoreceptor precursors derived from three-dimensional embryonic stem cell cultures integrate and mature within adult degenerate retina[J].Nat Biotechnol ,2013,31(8):741-747.

49 Lamba DA,McUsic A,Hirata RK,et al.Generation,purification and transplantation of photoreceptors derived from human induced pluripotent stem cells[J].PloS one,2010,5(1):e8763.

50 Chen M,Chen Q,Sun X,et al.Generation of retinal ganglion-like cells from reprogrammed mouse fibroblasts[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2010,51(11):5970-5978.

51 Hirami Y,Osakada F,Takahashi K,et al.Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells[J].Neurosci Lett,2009,458(3):126-131.

52 Tucker BA,Park IH,Qi SD,et al.Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice[J].PloS one,2011,6(4):e18992.