王亞莉 陳國軍 王金福 方鳳 崔玉華 張青 王迪 張靜

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對腦缺血新生小鼠運(yùn)動行為狀態(tài)異常的療效觀察

王亞莉 陳國軍 王金福 方鳳 崔玉華 張青 王迪 張靜

目的觀察人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對腦缺血小鼠行為的影響。方法40只7 ～ 8日齡新生鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組13只，僅做頸部皮膚的切開縫合，未結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈；手術(shù)組12只，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈；干細(xì)胞移植組15只，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈后4 d，給本組小鼠心腔注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞0.15 ml（含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞106）。同時給假手術(shù)組和手術(shù)組小鼠心腔注射0.15 ml生理鹽水。應(yīng)用動物行為學(xué)平臺（轉(zhuǎn)棒儀和曠場試驗）對36 ～ 37日齡小鼠進(jìn)行運(yùn)動和行為功能測定。運(yùn)動狀態(tài)以及行為狀態(tài)假手術(shù)組和手術(shù)組以及干細(xì)胞移植組3組采用隨機(jī)F檢驗及兩兩比較。結(jié)果（1）干細(xì)胞移植組和假手術(shù)組小鼠運(yùn)動降落的潛伏期明顯長于手術(shù)組，而假手術(shù)組和干細(xì)胞移植組的小鼠運(yùn)動降落的潛伏期長短無差異（F= 8.525，P= 0.001）；（2）在曠場實驗中3組小鼠跨格次數(shù)，運(yùn)動的總路程以及平均速度比較均無差異（均P> 0.05）；（3）干細(xì)胞移植組和假手術(shù)組小鼠周邊活動時間和距離明顯長于手術(shù)組（F= 8.370，P= 0.001），而假手術(shù)組和干細(xì)胞移植組的小鼠周邊活動時間和距離長短無差異（F= 3.541，P= 0.039）；（4）干細(xì)胞移植組和假手術(shù)組小鼠中心活動時間及路程明顯短于手術(shù)組（F= 7.201，P= 0.002），干細(xì)胞移植組和假手術(shù)組小鼠中心活動的時間和距離比較無差異（F= 6.044，P= 0.005）。結(jié)論腦缺血小鼠的運(yùn)動和行為狀態(tài)明顯受損，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可明顯改善腦缺血小鼠運(yùn)動和協(xié)調(diào)能力和認(rèn)知能力。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腦缺血；小鼠；運(yùn)動行為

腦缺血疾病是導(dǎo)致新生兒死亡和神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因之一，主要表現(xiàn)為運(yùn)動發(fā)育落后或各種運(yùn)動障礙，也可伴有智力低下、癲癇、行為異常以及感知覺障礙等。由于綜合治療策略對中重度腦缺血損傷收效甚微[1-2]，患兒給家庭和社會均造成沉重的負(fù)擔(dān)。近年來，隨著干細(xì)胞研究的進(jìn)展，干細(xì)胞移植為缺氧缺血性腦損傷（H IBD）的治療開辟了新的途徑[3-4]。本實驗采用乳鼠制作腦缺血模型[5-6]并給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療，采用轉(zhuǎn)棒及曠場實驗來分析小鼠的運(yùn)動及認(rèn)知行為的改變來觀察療效，為臨床治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。

材料與方法

一、動物和實驗分組

40只Wister新生子鼠購自上海斯來克實驗動物有限責(zé)任公司，體質(zhì)量18 ～ 22 g，在復(fù)旦大學(xué)國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物實驗室飼養(yǎng)，20 d母乳喂養(yǎng)，10 d分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。飼養(yǎng)條件：室溫（22 ± 2℃），濕度45﹪～ 55﹪。分為對照組（正常組，假手術(shù)組）13只、腦缺血（手術(shù)組，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎組）12只、腦缺血骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組15只，動物實驗獲得倫理委員會的批準(zhǔn)。

二、模型制備方法

（1）對照組（正常組，假手術(shù)組）：7 ～ 8日齡（P7-8）Wistar乳鼠用10﹪水合氯醛300 mg/kg麻醉并固定臺上，仰臥位作頸腹側(cè)正中切口，長2 ～ 3 cm，不做頸總動脈結(jié)扎，皮膚縫合并用青霉素注射液沖洗局部皮膚。（2）腦缺血干預(yù)組 ：7～ 8日齡（P7-8）Wistar乳鼠用10﹪水合氯醛300 mg/kg麻醉并固定臺上，仰臥位，常規(guī)消毒頸部皮膚，作頸腹側(cè)正中切口，長2 ～ 3 cm，仔細(xì)分離左側(cè)頸總動脈，在左側(cè)頸總動脈其遠(yuǎn)心端與近心端分別縫線結(jié)扎；再分離右側(cè)頸總動脈，在右側(cè)頸總動脈其遠(yuǎn)心端與近心端分別縫線結(jié)扎；縫合皮膚，再次消毒創(chuàng)面。術(shù)后在37 ～ 38℃衡溫毯復(fù)溫4 ～ 6 h后返籠飼養(yǎng)。術(shù)后由母鼠喂養(yǎng)[5-6]。

三、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備與移植

1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法：人骨髓標(biāo)本采集標(biāo)本來自腦癱患兒，患兒在接受自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化神經(jīng)干細(xì)胞移植治療后，剩余的細(xì)胞冷凍，細(xì)胞復(fù)蘇后用于實驗。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到108時，用PBS清洗2次后，滴加0.05﹪的Ttypsin-EDTA液消化，后加培養(yǎng)基終止消化，制成(1 ～ 3) × 106的細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測顯示CD34陰性，CD109陰性，CD29和CD44陽性率均> 95﹪。移植治療之前對細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行EB病毒、巨細(xì)胞病毒、HIV病毒、乙肝病毒、支原體、細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)均陰性。

2.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組：完成動物腦缺血模型制作后4 d，也就是小鼠（P11-12）11 ～12 d大小時給腦缺血骨髓干細(xì)胞干預(yù)組小鼠心臟注射人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞0.15 ml（含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞106）。同時給對照組及腦缺血組小鼠0.15 ml生理鹽水心臟注射。神經(jīng)行為狀態(tài)評定：術(shù)后29 ～ 30 d（P36-37）在復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院的動物行為學(xué)實驗室對Wister大鼠進(jìn)行曠場試驗和平衡能力測試，記錄數(shù)據(jù)。（1）MedAssociates美國大鼠轉(zhuǎn)棒儀（型號：ENV-575），該轉(zhuǎn)棒儀分為4道，可同時檢測4只動物。轉(zhuǎn)軸選擇勻加速為2.0 ～ 20、2.5 ～ 25、3.0 ～ 30、3.5 ～ 35及4.0 ～ 40 rpm。當(dāng)動物從轉(zhuǎn)軸上掉落時，切斷該道的紅外線，儀器自動記錄下時間；（2）Med Associates美國大鼠曠場實驗系統(tǒng)（型號：MEDVOF-RS）。實驗裝置由曠場反應(yīng)箱和數(shù)據(jù)自動采集和處理系統(tǒng)兩部分組成，大鼠曠場反應(yīng)箱高30～ 40 cm，底邊長100 cm，內(nèi)壁涂黑，底面平均分為25個4 cm × 4 cm小方格，正上方2 m處架一數(shù)碼攝像頭，其視野可覆蓋整個曠場內(nèi)部。實驗室背景噪音控制在65 dB以下。觀察時間10 min。

四、觀測項目和統(tǒng)計方法

1.觀測指標(biāo)：轉(zhuǎn)棒儀測試選擇小鼠降落的潛伏期（即在轉(zhuǎn)棒儀上的運(yùn)動時間）作為參考指標(biāo)。比較曠場試驗10 min總體反應(yīng)結(jié)果，選擇子鼠在曠場中的總路程、平均速度、跨格次數(shù)和中心與周邊區(qū)域活動時間及距離作為參考指標(biāo)。

2.統(tǒng)計學(xué)分析方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)采用形式表示。運(yùn)動狀態(tài)以及行為狀態(tài)假手術(shù)組和手術(shù)組以及干細(xì)胞移植組3組采用隨機(jī)F檢驗及兩兩比較，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、運(yùn)動狀態(tài)結(jié)果

用轉(zhuǎn)棒儀測定小鼠運(yùn)動狀態(tài)，結(jié)果見表1，干細(xì)胞移植組和假手術(shù)組小鼠降落的潛伏期明顯長于手術(shù)組，而假手術(shù)組和干細(xì)胞移植組的小鼠運(yùn)動降落的潛伏期長短無差異（F= 8.525，P= 0.001）。

表1 小鼠運(yùn)動狀態(tài)(± s)

表1 小鼠運(yùn)動狀態(tài)(± s)

注：a與2組比較，b與3組比較，P< 0.05

組別 例數(shù) 降落的潛伏期（s）假手術(shù)組① 13 159.700 ± 21.002a手術(shù)組② 12 131.615 ± 20.174b干細(xì)胞移植組③ 15 170.934 ± 30.867F值 8.525P值 0.001

二、行為狀態(tài)結(jié)果

用曠場反應(yīng)測定大鼠行為狀態(tài)（表2）。在曠場實驗中3組小鼠除平均速度（P= 0.020）外，跨格次數(shù)和運(yùn)動總路程比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）。

表2 曠場總體反應(yīng)結(jié)果(± s)

表2 曠場總體反應(yīng)結(jié)果(± s)

注：a與2組比較，b與3組比較，P< 0.05

組別 例數(shù) 總路程 平均速度 跨格次數(shù)假手術(shù)組① 13 1192.488 ± 120.360 28.061 ± 0.887 259.142 ± 36.439手術(shù)組② 12 1245.633 ± 293.598 27.172 ± 1.667 259.714 ± 86.969干細(xì)胞移植組③ 15 1133.93 ± 203.242 28.609 ± 1.160 238.889 ± 56.472F值 0.913 4.351 0.509P值 0.410 0.020 0.606

表3 曠場周邊和中心區(qū)域活動狀態(tài)結(jié)果(± s)

表3 曠場周邊和中心區(qū)域活動狀態(tài)結(jié)果(± s)

注：a與2組比較，b與3組比較，P< 0.05

組別 例數(shù) 周邊區(qū)活動t 周邊區(qū)活動d 中心區(qū)活動t 中心區(qū)活動d假手術(shù)組① 13 241.059 ± 21.122a 991.691 ± 124.106a 53.600 ± 15.718a 300.796 ± 60.418a手術(shù)組② 12 226.730 ± 9.557b 859.062 ± 145.44 68.127 ± 9.539b 371.745 ± 80.921b干細(xì)胞移植組③ 15 251.087 ± 13.083 1000.869 ± 172.360 48.907 ± 13.875 270.170 ± 84.676F值 8.370 3.541 7.201 6.044P值 0.001 0.039 0.002 0.005

三、曠場周邊和中心區(qū)域活動狀態(tài)結(jié)果

干細(xì)胞移植組和假手術(shù)組小鼠周邊活動時間和距離明顯長于手術(shù)組（F= 8.370，P= 0.001），而假手術(shù)組和干細(xì)胞移植組的小鼠周邊活動時間和距離長短無差異(F= 3.541，P= 0.039)。干細(xì)胞移植組和假手術(shù)組小鼠中心活動時間及路程明顯短與手術(shù)組(F= 7.201，P= 0.002)，干細(xì)胞移植組和假手術(shù)組小鼠中心活動的時間和距離比較無差異（F= 6.044，P= 0.005,表3）

討 論

BMSCs作為一種有潛能的干細(xì)胞，可自我更新，自我復(fù)制，橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞，且腦內(nèi)移植后可促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生 ，因而廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。對于嚴(yán)重的腦缺血損傷以往以對證治療以及康復(fù)、理療等方法為主，但往往收效甚微。國內(nèi)外已有大量的動物實驗證明間充質(zhì)干細(xì)胞對腦缺血動物的神經(jīng)系統(tǒng)有很好的修復(fù)作用，并可以通過順磁性氧化鐵粒子（MPIO）標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞后給腦損傷的動物移植，腦室注射后第二天頭顱MRI即可顯示MPIO標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞在病變部位出現(xiàn)，而靜脈注射后一周可檢測到移植的間充質(zhì)干細(xì)胞遷移到病變部位，移植后120 d，病理檢查發(fā)現(xiàn)不到10﹪的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，而且病灶中心形態(tài)測量，發(fā)現(xiàn)動物腦白質(zhì)量有增加[7-12]。以上實驗充分證明間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦缺血性損傷性疾病的可行性，同時也提示間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦損傷不僅僅是可以轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，更重要的是可以產(chǎn)生并通過旁分泌的形式釋放多種細(xì)胞因子，促進(jìn)損傷區(qū)域的修復(fù)。本研究采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈制作腦缺血模型，腦缺血其特征性的表現(xiàn)：運(yùn)動功能的損害，姿勢的異常，智力及認(rèn)知功能發(fā)育遲緩，故生物學(xué)行為檢驗是腦缺血動物模型檢驗中重要的手段[13]。轉(zhuǎn)棒儀用于檢測動物的運(yùn)動協(xié)調(diào)性和疲勞性。大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間長短，表示其運(yùn)動協(xié)調(diào)能力可說明錐體外系、小腦及周圍神經(jīng)是否受到損傷。轉(zhuǎn)棒實驗中降落的潛伏期時間越長提示小鼠的協(xié)調(diào)性能越好，越不易疲勞，反之則越差。轉(zhuǎn)棒實驗分析發(fā)現(xiàn)，手術(shù)組小鼠轉(zhuǎn)棒降落潛伏期明顯低于假手術(shù)組，細(xì)胞移植組小鼠降落的潛伏期明顯長于手術(shù)組小鼠的降落的潛伏期。提示手術(shù)組小鼠存在運(yùn)動協(xié)調(diào)性下降和疲勞性增加；而細(xì)胞移植能夠明顯提高手術(shù)干預(yù)小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)性和疲勞性狀態(tài)[14]。曠場試驗可用于測試動物的活動量、活躍程度、探索行為及對新空曠環(huán)境的認(rèn)知能力。通過觀察新異環(huán)境中自主行為、探究行為和緊張度等，可反映鼠心理行為狀態(tài)。常態(tài)小鼠喜歡群居和洞穴，在開放的環(huán)境中，小鼠習(xí)性是喜歡在周邊區(qū)活動；曠場試驗的場地對小鼠來說是非常寬廣的新環(huán)境，對此開放的場所小鼠會產(chǎn)生焦慮，總路程和平均速度以及跨格次數(shù)被視為反映小鼠自發(fā)運(yùn)動的主要數(shù)據(jù)[15-17]。本實驗中3組小鼠在曠場實驗運(yùn)動運(yùn)動總路程和跨格次數(shù)等自發(fā)運(yùn)動數(shù)據(jù)顯示無顯著差異，但平均速度則差異顯著。在周邊運(yùn)動時間和路程以及中心運(yùn)動時間和路程上有明顯差異，手術(shù)組小鼠明顯存在中心活動時間及路程的增長較假手術(shù)組，說明腦缺血小鼠存在情緒的障礙以及認(rèn)知功能障礙，而干細(xì)胞移植組小鼠周邊活動時間和路程明顯長于手術(shù)組而同假手術(shù)組無差異，提示干細(xì)胞移植可以糾正腦缺血小鼠的緊張焦慮的情緒異常，并增加對新環(huán)境的的認(rèn)知能力，保持常態(tài)的周邊活動的習(xí)性。本實驗通過對小鼠運(yùn)動行為學(xué)分析發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷后小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力以及認(rèn)知能力明顯受損，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可明顯改善腦缺血受損小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力及認(rèn)知能力。為干細(xì)胞用于臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on cerebral ischemia mice behavior

Wang Yali*,Chen Guojun,Wang JinFu,Cui YuHua,Fang Feng,Zhang Qing,Wang Di,Zhang Jing.*Zhejiang Armed Police Hospital,Jiaxing 314000,China

Wang JinFu:Email:wjfu@zju.edu.cn

Objective To examine the effects of human bone marrow mesenchymal stem cells on behaviors of cerebral ischemia mice.Methods40 neonatal mice of 7-8 day old were randomly divided into sham group with only neck skin incision and no carotid artery ligation,surgery group with the ligation of bilateral common carotid artery and stem cell transplantation group with the ligation of bilateral common carotid artery.After 4 days,neonatal mice in the stem cell transplantation group were injected with 0.15ml of bone marrow mesenchymal stem cells (1×106cells) to the heart of neonatal mice.Neonatal mice in the sham group and surgery group received only an injection of 0.15ml saline.After 30 days mice were evaluated for the movement and behavioral functions with the ethology platform (bar-transferring meter and open-field test).Results(1) The time at which each animal fell from the drum was much longer in the stem cell transplantation group and the sham group than those in the surgery group ,and was not significantly different between the sham group and stem cell transplantation group (F=8.525，P= 0.001).(2) In the open field test,the grid-crossing frequency,the total distance and the average movement speed of mice between three groups were not significantly different (P> 0.05).(3) The time and distance of peripheral activity of mice in the stem cell transplantation group and the sham group were much longer than those of mice in the surgery group (F= 8.370，P= 0.001),and there was difference between the sham group and the stem cell transplantation group (F= 3.541，P= 0.039).(4) The time and distance of center activity of mice in the stem cell transplantation group and the sham group were much shorter than those of mice in the surgery group (F= 7.201，P= 0.002),and there was no difference between the sham group and the stem cell transplantation group (F= 6.044，P= 0.005).ConclusionThe transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells can significantly improve the movement,coordination skills and cognitive abilities of cerebral ischemia mice.

Bone mesenchymal stem cells；Brain ischemia；Mice；Motor activity

2013-10-24)

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.02.002

嘉興重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊基金（20121208）

31400 嘉興，浙江武警總隊醫(yī)院（王亞莉、陳國軍、方鳳、崔玉華、張青、王迪、張靜）；浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（王金福）

王金福，Email：wjfu@zju.edu.cn

王亞莉,陳國軍,王金福,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對腦缺血新生小鼠運(yùn)動行為狀態(tài)異常的療效觀察[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志:電子版,2014,4(2):84-88.