米寧，劉婕

（1.遂寧市中心醫(yī)院骨科，遂寧 629000；2.遂寧市中心醫(yī)院腫瘤科，遂寧 629000）

骨巨細(xì)胞瘤（giant cell tumor of bone，GCT）是一種具有潛在侵襲性及惡變性的良性原發(fā)性腫瘤，在骨原發(fā)性腫瘤中約占3%～6%，骨良性腫瘤中約占17%。GCT主要發(fā)生于20～40歲，多為女性，統(tǒng)計(jì)資料［1］顯示我國GCT發(fā)病率高于西方國家。GCT病變主要位于骨骺，如果病變較大則可擴(kuò)展至干骺端甚至骨干。常見發(fā)病部位包括股骨遠(yuǎn)端、橈骨遠(yuǎn)端、脛骨近端、肱骨近端和骶骨等。統(tǒng)計(jì)資料顯示GCT患者約80%為良性，25%～50%患者經(jīng)過治療后復(fù)發(fā)，少數(shù)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，極少數(shù)在放療或復(fù)發(fā)后惡變。目前臨床上最常用Jaffe、Enennecking和Campanacci外科分期法，影像學(xué)分型和病理學(xué)分級均不能準(zhǔn)確預(yù)測GCT的生物行為，也不能準(zhǔn)確評估預(yù)后情況，由此需要探尋一種影響GCT生物行為以及預(yù)后的相關(guān)檢測指標(biāo)［2］。本研究分析細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinases inducer，CD147）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在GCT組織中的表達(dá)情況及與臨床病理和預(yù)后的相關(guān)性，旨在為臨床判斷GCT生物學(xué)行為以及評估其預(yù)后提供準(zhǔn)確的參考指標(biāo)，為臨床治療提供一種新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

所選68個(gè)標(biāo)本來源于骨科2008年4月～2013年4月收治的GCT患者，其中男29例，女39例；年齡13～56歲，平均（33.5±4.7）歲，均行手術(shù)治療，其中8例單純刮除，24例刮除＋植骨，20例切除＋植骨，16例切除＋人工關(guān)節(jié)置換。取材部位包括脊柱6例、尺骨2例、橈骨5例、股骨23例、脛骨10例、骶骨10例、髂骨5例、指骨7例。選取標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為GCT并參照J(rèn)affe外科分級標(biāo)準(zhǔn)［3］：Ⅰ級25例，Ⅱ級34例，Ⅲ級9例。標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片機(jī)4μm連續(xù)切片，常規(guī)蘇木素－伊紅（HE）染色。

1.2 主要試劑、設(shè)備

1.2.1 試劑 免疫組化染色試劑盒，濃縮型DAB試劑盒，抗原修復(fù)液，兔抗人 CD147、MMP－2、MMP－9、VEGF多克隆抗體，PBS，蘇木精。

1.2.2 設(shè)備AMERITOOL公司切片機(jī)、OLYMPUS公司顯微鏡、LEICA 相機(jī)、EPPENDORF離心機(jī)、GILSON移液槍、國產(chǎn)水浴箱、SIEMENS 4℃冰箱。

1.3 S－P染色方法

1）石蠟包埋后，4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟置水。2）抗原修復(fù)，每張切片處理3次，2min／次。3）PBS沖洗3次，5min／次，于室溫下3%H2O2處理15 min徹底滅活內(nèi)源性過氧化物酶。4）PBS沖洗3次，5min／次，于室溫下滴加5%山羊血清封閉液，保持30min，將多余液體除去。5）加入一抗，CD147（1∶100）、MMP－2（1∶100）、MMP－9（1∶150）、VEGF（1∶100），將其置于4℃冰箱中過夜。6）37℃下孵育1h。7）PBS沖洗，每張切片處理3次，5min／次，加入通用的二抗后處理30min。8）PBS沖洗，每張切片處理3次，5min／次，加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素液后處理30min。9）PBS沖洗，每張切片處理3次，5min／次，DAB試劑顯色，顯微鏡下觀察，5～15min后水洗并終止顯色反應(yīng)。10）蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.4 計(jì)數(shù)方法

GCT內(nèi)任一孤立棕黃色細(xì)胞或者細(xì)胞簇均視為一條單獨(dú)的血管，有無管腔及紅細(xì)胞并不作為將其判定為血管的必要條件，已經(jīng)形成的肌層血管、分辨不清、染色模糊的細(xì)胞不計(jì)，低倍鏡下找到內(nèi)含微血管最為豐富的腫瘤組織即“熱點(diǎn)”，高倍鏡下計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)目，取其平均值分析。

1.5 染色判定標(biāo)準(zhǔn)

高倍鏡下觀察每張切片，選取5個(gè)不同視野，觀察陽性細(xì)胞的數(shù)量及其染色情況，陽性細(xì)胞為胞漿或胞膜淺黃色或棕黃色，綜合陽性細(xì)胞數(shù)量及染色強(qiáng)度進(jìn)行分級［4］。陽性細(xì)胞所占百分比分級評分標(biāo)準(zhǔn)：1分（1%～25%）、2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（＞75%）；染色程度分級評分標(biāo)準(zhǔn)：0分（無色）、1分（淺黃色）、2分（黃色）、3分（棕黃色）。上述陽性細(xì)胞所占百分比分級評分乘以染色程度分級評分后分為4個(gè)等級：0～1分為（－）、2～3分（＋）、4～5分（＋＋）、＞6分（＋＋＋）（見表1）。

表1 S－P計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)（分）

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選用SPSS18.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，CD147、VEGF、MMP－9與患者性別、年齡、分級、預(yù)后之間的關(guān)系采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，CD147與VEGF、MMP－9、MMP－2 表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α＝0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理分析

CD147于GCT組織中染色強(qiáng)度不一，單核基質(zhì)細(xì)胞的胞漿內(nèi)和包膜上主要表達(dá)呈棕黃色顆粒狀的陽性物質(zhì)，多核巨細(xì)胞也會存在少量的表達(dá)。MMP－2、MMP－9主要表達(dá)于多核巨細(xì)胞，呈現(xiàn)胞漿著色，棕黃色為陽性物質(zhì)，在部分單核基質(zhì)細(xì)胞中也有一定的表達(dá)。VEGF在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、多核和單核細(xì)胞內(nèi)均有陽性表達(dá)。

2.2 CD147、VEGF陽性表達(dá)和臨床病理參數(shù)關(guān)系分析

患者性別、年齡與CD147、VEGF陽性表達(dá)無相關(guān)（見表2）；各級Jaffe患者CD147與 MMP－2陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），預(yù)后各分組CD147、MMP－2、MMP－9陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表3）。

表2 CD147、VEGF陽性表達(dá)和年齡、性別的關(guān)系（n）

表3 Jaffe分級和預(yù)后與CD147、VEGF陽性表達(dá)的關(guān)系

2.3 CD147與VEGF陽性表達(dá)相關(guān)性分析

通過Spearman相關(guān)性分析，CD147的表達(dá)和MMP－9的表達(dá)呈正相關(guān)（R＝0.273，P＝0.025），CD147的表達(dá)和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)（R＝0.417，P＜0.001），提示CD147與VEGF等表達(dá)之間存在密切聯(lián)系，其可能影響或者調(diào)控其他因子的表達(dá)。

3 討論

GCT是一種較為常見的骨原發(fā)性良性腫瘤，具有一定的惡變性，目前已明確其細(xì)胞組分，主要包括單核細(xì)胞樣細(xì)胞、單核基質(zhì)細(xì)胞、多核巨細(xì)胞，但上述細(xì)胞的起源和在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的相關(guān)作用還需進(jìn)一步研究，另外GCT發(fā)生發(fā)展涉及的眾多細(xì)胞因子以及信號通路的相關(guān)作用機(jī)制也尚未闡明。臨床上治療GCT首選手術(shù)治療，但患者在術(shù)后仍存在復(fù)發(fā)以及惡變的危險(xiǎn)性［5］。

CD147是一種廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，其為多效性分子，在胎兒的發(fā)育以及視網(wǎng)膜功能方面起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)對于胸腺T細(xì)胞的發(fā)展過程也具有一定作用，與淋巴細(xì)胞應(yīng)答程序、組織重建、空間認(rèn)知和精子發(fā)生等也有著密切關(guān)系［6］。CD147在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用：1）促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；2）誘導(dǎo)腫瘤血管的生成；3）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞錨著非依賴性生長。臨床研究已經(jīng)在眾多的腫瘤組織如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成釉細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、肺癌中發(fā)現(xiàn)了CD147表達(dá)，在腫瘤的發(fā)展過程中刺激并誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的生成，主要通過直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞兩種途徑來實(shí)現(xiàn)。近年來研究［7］發(fā)現(xiàn)其還可能直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞本身而產(chǎn)生MMPs。

CD147可通過誘導(dǎo)VEGF來調(diào)控血管的生成，此為CD147調(diào)控腫瘤發(fā)展并表達(dá)轉(zhuǎn)移潛力的另一方面作用。VEGF在大多情況下主要調(diào)節(jié)血管生成過程，其中也包括腫瘤形成過程。體內(nèi)外臨床研究顯示，CD147的表達(dá)和VEGF的誘導(dǎo)關(guān)系密切。CD147過度表達(dá)時(shí)可刺激腫瘤的生長及血管的生成，此過程會因CD147表達(dá)的抑制而抑制。CD147的功能和附著糖的類型與腫瘤存在直接關(guān)系，可推測細(xì)胞外基質(zhì)可能在CD147糖基化過程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)考慮到MMPs的表達(dá)誘導(dǎo)也需要糖基化，提示糖基化過程可能為調(diào)控CD147的重要機(jī)制，可作為今后治療方向進(jìn)行研究［8］。

近年來臨床研究證實(shí)腫瘤的組織學(xué)表現(xiàn)和生物學(xué)行為之間存在不一致性，Jaffe分級以及Enneking影像學(xué)分級雖具有判定GCT局部浸潤的作用，但無法預(yù)測其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示：患者的性別、年齡和CD147、VEGF陽性表達(dá)無相關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此患者年齡、性別不能作為判斷GCT侵襲以及復(fù)發(fā)的指標(biāo)。各級Jaffe患者CD147與MMP－2陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），預(yù)后各分組CD147、MMP－2、MMP－9陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示CD147與MMPs、GCT侵襲和預(yù)后相關(guān)，可作為臨床評估GCT預(yù)后的重要參考指標(biāo)。CD147與VEGF、MMP－9等因子表達(dá)呈正相關(guān)，提示CD147可能促進(jìn)VEGF的表達(dá)，并通過細(xì)胞外基質(zhì)和促進(jìn)腫瘤血管生成來為腫瘤的增殖以及轉(zhuǎn)移提供有利條件。

綜上所述，CD147的陽性表達(dá)與GCT患者病情惡化及復(fù)發(fā)有著密切關(guān)系，并且和 MMP－9、VEGF的陽性表達(dá)密切相關(guān)，是目前臨床上評價(jià)GCT惡性程度以及評估預(yù)后的重要檢測指標(biāo)；也可作為化療新靶點(diǎn)，為臨床診斷和治療提供新的思路。

［1］于飛，劉曉晴.PDGF－C在腫瘤生長及腫瘤抗VEGF治療耐藥中的作用［J］.腫瘤預(yù)防與治療，2013，26（1）：33－37.

［2］韓躍虎，楊柳，黃景輝，等.CD147、PCNA、VEGF和 MMPs在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義［J］.中國骨與關(guān)節(jié)外科，2012，5（1）：65－71.

［3］韓躍虎.CD147、PCNA、VEGF和 MMPs在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義［D］.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2012.

［4］畢乃貴，王民，王瑩.CD147在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，15（12）：1846－1848.

［5］廖通權(quán).CD147／EMMPRIN對體外破骨細(xì)胞分化成熟及活化影響的實(shí)驗(yàn)研究［D］.重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2011.

［6］柳忠興.CD147和Survivin在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其臨床意義［D］.泰安：泰山醫(yī)學(xué)院，2010.

［7］蘭杰，劉曉光，韋峰，等.骨巨細(xì)胞瘤生物學(xué)特性研究進(jìn)展［J］.中華外科雜志，2012，50（5）：468－470.

［8］柳忠興，于秀淳.CD147和Survivin在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國骨與關(guān)節(jié)雜志，2012，1（3）：253－257.