韓楓，凌心

（徐州市腫瘤醫(yī)院藥劑科，徐州 221005）

百 草 枯 ［1，l＇－二 甲 基－4，4＇聯(lián)吡啶氯化物］（paraquat，PQ），又名克蕪蹤，為有機(jī)雜環(huán)類除草劑，因誤服等因素造成的PQ中毒較為常見(jiàn)［1］，其病死率可高達(dá)60.0%～81.6%［2］，患者多死于多臟器功能衰竭或呼吸衰竭。近年來(lái)上市的吡非尼酮（pirfenidone，PF）是用于治療肺纖維化的藥物，研究［3］證實(shí)其具有抗炎、抗氧化作用。據(jù)報(bào)道［4］，鹽酸氨溴索（ambroxol hydrochloride，AH）對(duì)PQ中毒大鼠肺損傷具有保護(hù)作用，因此本研究通過(guò)建立大鼠PQ中毒肺損傷模型，初步探討PF和AH對(duì)PQ中毒所致大鼠急性肺損傷是否有保護(hù)作用，并比較各組相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品和試劑

雄性成年SD大鼠40只，體質(zhì)量280～300g，徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供；PF（純度99%），南京榮世醫(yī)藥科技有限公司；AH，常州四藥制藥有限公司，規(guī)格30mg／支，批號(hào)20120511T2；20%PQ 溶液，山東三元工貿(mào)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；大鼠白細(xì)胞介素－6（IL－6）和腫瘤壞死因子α（TNF－α）ELISA 試劑盒，上海西塘生物有限公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

UV－754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TGL－16G臺(tái)式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；SSH－2型電熱恒溫水浴鍋，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；IX71光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠急性肺損傷模型的制備 將SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、PQ組、AH陽(yáng)性對(duì)照組（AH組）及PF治療組（PF組）。自由飲食1w后，PQ組、AH組和PF組大鼠給予一次性腹腔注射PQ溶液25mg／kg，正常對(duì)照組給予腹腔注射等量生理鹽水。腹腔注射1h后，PF組灌胃給予PF治療，PF劑量為50mg／kg［溶于0.5%的羧甲基纖維素納（CMC－Na中）］，AH 組給予腹腔注射 AH 50mg／kg（每只 AH 針劑加入1mL生理鹽水，配成30mg／mL溶液），正常對(duì)照組大鼠灌胃給予等量CMC－Na溶液。

1.3.2 樣本采集 連續(xù)給藥1w后，麻醉各組大鼠；腹主動(dòng)脈采血，3 500r／min離心15min，分離血清，用于測(cè)定炎癥因子。取大鼠左肺置于體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定液中固定，取右肺上葉稱重后置于烤箱中，70℃烘烤至恒重后稱干重，計(jì)算肺組織濕重／干重比（W／D）值，立刻將其與左肺保存于－80℃，并進(jìn)行后續(xù)生化指標(biāo)測(cè)定。

1.3.3 組織病理學(xué)觀察 將固定好的大鼠左肺組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)性49μm切片，蘇木精－伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.3.4 生化指標(biāo)測(cè)定 大鼠右肺組織勻漿后，3 000r／min離心10min，取上清，測(cè)定SOD、MDA和GSH的水平，嚴(yán)格按照試劑盒規(guī)定的方法比色測(cè)定吸光度，按公式換算成SOD的活性以及MDA和GSH的濃度。

1.3.5 TNF－α及IL－6含量測(cè)定 ELISA 法測(cè)定離心后的血清中TNF－α及IL－6含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用oneway ANOVA分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡間隔無(wú)增寬及充血，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及出血現(xiàn)象（見(jiàn)圖1A）；PQ組大鼠肺組織成纖維細(xì)胞大量增殖，肺充血、肺水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)病變嚴(yán)重處見(jiàn)纖維瘢痕樣組織，肺泡萎陷或消失（見(jiàn)圖1B）；AH組肺組織損失明顯減輕（見(jiàn)圖1C）；給予PF治療后肺組織損傷情況減輕（見(jiàn)圖1D）。

圖1 肺組織HE染色

2.2 肺組織濕重／干重比（W／D）

與正常對(duì)照組比較，PQ組 W／D值顯著上升（P＜0.01）；與PQ組相比，AH 組 W／D降低 （P＜0.05），PF組 W／D 降低 （P＜0.05）；PF組與 AH組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 PF對(duì)小鼠肺組織SOD活性和MDA含量的影響（±s，n＝6）

表1 PF對(duì)小鼠肺組織SOD活性和MDA含量的影響（±s，n＝6）

與正常對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01；與PQ組比較，＃P＜0.05

組別 W／D正常對(duì)照組2.36±0.22 PQ組 6.03±0.16＊＊AH組 3.91±0.12＃PF組 4.21±0.14＃

2.3 肺組織SOD活性、MDA和GSH含量

與正常對(duì)照組比較，PQ組肺組織SOD活性顯著降低 （P＜0.001），MDA含量顯著升高 （P＜0.001），GSH含量顯著降低 （P＜0.01）；與PQ 組比較，AH組大鼠肺組織SOD活性升高 （P＜0.05），MDA含量降低（P＜0.05），GSH 含量升高（P＜0.05）；與PQ組比較，PF組大鼠肺組織SOD活性升高 （P＜0.05），MDA含量降低（P＜0.05），GSH含量升高（P＜0.05）；PF組SOD活性、MDA及GSH含量與AH組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表2）。

表2 PF對(duì)小鼠肺組織SOD活性和MDA含量的影響（±s，n＝6）

表2 PF對(duì)小鼠肺組織SOD活性和MDA含量的影響（±s，n＝6）

與正常對(duì)照組比較，＊＊＊P＜0.001，＊＊P＜0.01；與PQ組比較，＃P＜0.05

組別 SOD／kU·g－1 MDA／mmol·g－1 GSH／mg·g－1正常對(duì)照組210.11±6.24 1.81±0.13 1.3±0.04 PQ組 99.75±4.56＊＊＊ 3.04±0.58＊＊0.7±0.03＊＊AH組 185.32±5.75＃2.02±0.26＃1.1±0.08＃PF組 162.21±4.40＃2.13±0.28＃1.0±0.04＃

2.4 血清中IL－6和TNF－α含量

與正常對(duì)照組比較，PQ 組血清中IL－6和TNF－α含量顯著升高 （P＜0.001）；與PQ組比較，AH組IL－6和 TNF－α含量明顯降低 （P＜0.01）；與PQ組比較，PF組IL－6和TNF－α含量亦降低 （P＜0.01）；PF組IL－6和 TNF－α含量與 AH 組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表3）。

表3 大鼠血清中IL－6和TNF－α含量（±s，n＝6）

表3 大鼠血清中IL－6和TNF－α含量（±s，n＝6）

與正常對(duì)照組比較，＊＊＊P＜0.001；與PQ組比較，＃＃P＜0.01

組別 IL－6（pg／mL） TNF－α（pg／mL）正常對(duì)照組10.58±4.35 70.30±10.11 PQ組 592.76±5.62＊＊＊637.90± 5.89＊＊＊AH組 326.82±3.77＃＃190.50± 6.43＃＃PF組 384.54±2.89＃＃222.53±11.32＃＃

3 討論

急性肺損傷作為PQ中毒的主要臨床表現(xiàn)，目前認(rèn)為其發(fā)生可能主要與氧自由基、過(guò)度脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)所產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物及體內(nèi)減少的還原型GSH有關(guān)［5］，復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制導(dǎo)致其臨床治療難度較大。在PQ中毒的臨床治療方面，血漿灌流和血液置換是目前降低患者死亡率的最有效措施，但由于多數(shù)患者無(wú)法得到及時(shí)救治，臨床治療效果依然不容樂(lè)觀。肺損傷的出現(xiàn)，除導(dǎo)致患者呼吸系統(tǒng)障礙以外，大量炎性介質(zhì)“瀑布式釋放”同樣會(huì)促進(jìn)其它器官的損傷，最終使患者死于心衰或全身器官功能衰竭等合并癥［6］。因此，及時(shí)有效地改善PQ中毒患者的肺損失和呼吸系統(tǒng)癥狀，對(duì)于降低患者的死亡率和提高患者搶救成功后的生存質(zhì)量均有重要的臨床意義。但是在PQ中毒的臨床用藥方面，激素類藥物、依達(dá)拉奉以及N－乙酞半膚氨等典型藥物目前僅被證明在PQ中毒的動(dòng)物模型中具有較好的治療效果［7］，但在人體研究方面尚缺乏可靠的臨床結(jié)論，高效、安全的抗PQ中毒癥狀的藥物亟待開(kāi)發(fā)。

在本次研究中，分別以AH和PF為模型藥物，對(duì)PQ誘導(dǎo)大鼠模型的急性肺損傷進(jìn)行治療。研究發(fā)現(xiàn)，給予PQ中毒大鼠PF或AH治療后，肺組織SOD活性、GSH含量均上升，且 MDA含量下降，W／D下降；HE染色結(jié)果亦表明，PF或AH治療后，肺損傷減輕，血清中IL－6和TNF－α的含量均降低，提示PF和AH均可明顯降低PQ中毒大鼠肺組織中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)水平。鄭玉蘭等［8］和李偉［9］分別以AH和PF為治療藥物，對(duì)其抗PQ所致肺損傷的臨床療效和機(jī)制進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)論與本研究的結(jié)果基本一致。本研究所涉及的評(píng)價(jià)指標(biāo)中，肺組織W／D的變化可較好地反映肺間質(zhì)及肺泡血管通透性改變，SOD、MDA及GSH常作為自由基損傷的觀察指標(biāo)，其水平的變化可大致反映機(jī)體清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的能力，進(jìn)一步表明PF和AH抗PQ誘導(dǎo)的肺損傷作用機(jī)制與改變肺組織自由基活性及炎癥反應(yīng)有關(guān)。此外，PF組與AH組的治療效果對(duì)比顯示，兩組的各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與既往研究［10］基本一致。

綜上所述，PF和AH在改善PQ誘導(dǎo)的肺損傷方面均具有明確的臨床療效，可為該類中毒癥狀的治療提供參考。但由于目前國(guó)內(nèi)外均缺乏大樣本量的人體研究結(jié)論，更加深入、全面、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯咳杂斜匾?/p>

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