柳云恩，劉欣偉，施琳，張玉彪，徐婷婷，高燕，侯明曉＊

（1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院急診醫(yī)學部，全軍重癥（戰(zhàn)）創(chuàng)傷救治中心實驗室，沈陽 110840；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院骨科，全軍重癥（戰(zhàn)）創(chuàng)傷救治中心，沈陽 110840）

膠質(zhì)瘤在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中高居首位，其術(shù)后極易復發(fā)，化療藥物因耐藥性及血腦屏障的限制，治療效果受到很大制約［1］。人參皂甙Rg3是一種人參二醇類四環(huán)三萜皂苷，根據(jù)其第20位碳的構(gòu)型可分20（R）與20（S）－人參皂甙 Rg3，盡管兩者互為同型異構(gòu)體，但功能卻不盡相同。Sin等［2］發(fā)現(xiàn)20（S）－人參皂甙Rg3通過Akt和p53／p21依賴性信號傳導途徑，使人膠質(zhì)瘤細胞生長停滯。20（R）－人參皂甙Rg3研究歷史較短，但其具有抑制腫瘤生長、抗腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤、提高機體免疫力等作用，將可以作為腫瘤治療中的一種重要方法。人參皂甙20（R）－Rg3對人膠質(zhì)瘤U87凋亡的影響及機制尚不清楚。本研究旨在研究不同濃度Rg3對人膠質(zhì)瘤U87細胞凋亡的影響，并深入探討凋亡發(fā)生的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細胞株U87購自中國科學院上海細胞研究所，細胞培養(yǎng)采用10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液（Corning公司）。細胞在37℃，5%CO2飽和濕度下傳代，取用對數(shù)生長期的細胞進行研究。

1.1.2 藥物 人參皂甙Rg3由大連富生生物技術(shù)公司惠贈，純度99.69%，用二甲基亞砜（DMSO）助溶，然后用RPMI1640細胞培養(yǎng)液稀釋成以下6個濃度：200、100、50、25、12.5和6.25μg／mL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 四唑鹽（MTT）比色法 對數(shù)生長期細胞經(jīng)0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×104／mL，每孔200μL細胞懸液于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，在37℃，5%CO2飽和濕度孵育箱內(nèi)過夜，取出培養(yǎng)板，棄取舊培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的Rg3（200、100、50、25、12.5和6.25μg／mL）和相應(yīng)濃度的輔料 （50、25、12.5、6.25、3.125 和 1.563mg／mL），200μL／孔，空白對照組加入DMEM 培養(yǎng)液200μL，每組設(shè)4個平行孔，分別于24h，48h及72h取出96孔板，每孔加入 MTT（5mg／mL）20μL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞內(nèi)MTT與線粒體酶反應(yīng)后生成的藍紫色結(jié)晶物，棄上清液，每孔加DMSO 150μL，室溫震蕩10min，用酶標儀檢測570nm波長處的吸光度（A）值，實驗共重復3次。按下列公式計算細胞生長抑制率（100%）＝（1－加藥孔平均A值／對照孔平均A值）×100%。

1.2.2 AO／EB雙熒光染色法 取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板內(nèi)，加入不同劑量Rg3，各孔終濃度分別為0、12.5、25和50μg／mL，24h后用0.25%胰酶消化細胞，用PBS液洗滌，使其終體積為20 μL，加入AO／EB染液1μL。在熒光顯微鏡下觀察涂片細胞的凋亡，選取3個不同視野，計算細胞凋亡率，每組設(shè)3個平行孔。凋亡率（%）＝（早期凋亡細胞＋晚期凋亡細胞）／總細胞數(shù)×100%。

1.2.3 AnnexinV／PI雙染法 取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板內(nèi)，加入不同劑量Rg3，使各孔終濃度分別為0、12.5、25和50μg／mL。制成單細胞懸液經(jīng)PBS液洗滌兩次后，加入AnnexinV 10μL，避光孵育30min，離心收集細胞。將細胞再次重懸后加入PI 5μL。采用流式細胞儀檢測混合液細胞的凋亡狀況。正常細胞：AnnexinV／PI（－）；早期凋亡：AnnexinV（＋）、AnnexinPI（－）；晚期凋亡細胞或壞死細胞：AnnexinV／PI（＋）。

1.2.4 Western Blotting蛋白印跡 提取對數(shù)生長期細胞的蛋白，每孔加入20μL，經(jīng)SDS－PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜2h，將轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素膜置入TBST緩沖液中漂洗后，把膜放入稀釋的一抗中［PAkt（ser473）兔多抗（1∶1 000）、Akt兔多抗（1∶1 000）、Bcl－2鼠單抗（1∶100）、Bax鼠單抗（1∶200）、β－actin兔多抗（1∶500）］，溫和震蕩3h后置于4℃冰箱中過夜。回收一抗在TBST液中洗膜30min，把膜置入相應(yīng)稀釋的二抗中。取ECL試劑A和試劑B各0.5mL，混合后覆蓋硝酸纖維素膜上，在暗室內(nèi)同時放入X光膠片并作為方向標記，用底片掃描儀掃描X光，通過凝膠成像系統(tǒng)讀取目的電泳帶的密度掃描值，應(yīng)用Quantity One軟件定量分析目的條帶與Actin的灰度值并計算比值。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂甙20（R）－Rg3對U87細胞生長的影響

與人參皂甙20（R）－Rg3 6.25μg／mL組相比，其他濃度組人參皂甙20（R）－Rg3在同一作用時間內(nèi)均對人膠質(zhì)瘤U87細胞產(chǎn)生抑制作用，差異均有統(tǒng)計學意義（P＝0.03）。人參皂甙20（R）－Rg3對腫瘤細胞的抑制效果有時間依賴性，與24h相比，48h及72h組20（R）－Rg3對腫瘤的抑制效果差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.04）（見表1）。

2.2 AO／EB雙熒光染色法檢測Rg3對U87細胞凋亡的影響

人參皂甙20（R）－Rg3 25μg／mL作用于 U87細胞，可導致細胞發(fā)生不同的形態(tài)改變（見圖1）。隨著Rg3濃度越高，腫瘤細胞發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡的比例逐漸增高，凋亡細胞與正常細胞比例幾乎接近1∶1。

表1 人參皂甙20（R）－Rg3對U87細胞生長的抑制率 （n＝4，%）

圖1 U87細胞AO／EB雙熒光下凋亡的形態(tài)學表現(xiàn)

2.3 Rg3對U87細胞中Bcl－2家族凋亡及侵襲蛋白影響

經(jīng)不同濃度人參皂甙20（R）－Rg3作用于U87細胞72h后，實驗發(fā)現(xiàn)Rg3可以顯著降低腫瘤細胞U87中抑凋亡蛋白Bcl－2表達水平，升高促凋亡蛋白Bax的表達。隨著Rg3濃度的增加，U87細胞中Bax／Bcl－2比值呈濃度依賴性增加（見圖2）。

圖2 Rg3對U87細胞中Bcl－2、Bax表達的影響

2.4 Rg3對U87細胞中PI3k／Akt信號通路的影響

經(jīng)不同濃度人參皂甙20（R）－Rg3作用于U87細胞72h后，Western Blot蛋白印跡結(jié)果顯示，Rg3顯著降低腫瘤細胞磷酸化蛋白p－Akt（Ser473）的表達，而并未影響t－Akt蛋白的表達（圖4）。

圖3 Rg3對U87細胞中PI3K／Akt信號通路蛋白表達的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)6.25μg／mL人參皂甙20（R）－Rg3作用于人膠質(zhì)瘤U87細胞24h后，可抑制腫瘤細胞的生長，隨時間的延長抑制效果顯著，而高濃度的Rg3（200μg／mL）對腫瘤細胞的生長抑制率可達97%以上，抑制呈時間－劑量依賴性。本研究采用形態(tài)學觀察和流式細胞儀檢測兩種手段對Rg3處理的U87細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)人參皂甙20（R）－Rg3處理過的U87細胞體積縮小、核固縮，染色質(zhì)凝集，部分染色質(zhì)斷裂成小塊等典型的凋亡細胞表現(xiàn)。凋亡細胞數(shù)量隨Rg3濃度增高而明顯增多，流式細胞檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Rg3處理24h后，腫瘤細胞凋亡比例明顯增加。結(jié)果提示人參皂甙20（R）－Rg3通過促進細胞凋亡，抑制膠質(zhì)瘤U87細胞的生長。

細胞凋亡受控于一個異常復雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，PI3K／Akt信號傳導是調(diào)節(jié)細胞凋亡的一個重要通路［3］，胃癌、乳腺癌、腎癌及多種腫瘤均存在PI3K／Akt通路的異?；罨＝陙?，研究［4］發(fā)現(xiàn)70%的膠質(zhì)瘤也存在PI3K／Akt信號通路的活化，Akt是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，位于PI3K／Akt信號傳導通路的核心部位。活化的Akt在介導細胞生長和增殖、細胞凋亡和抵制放化療方面發(fā)揮重要作用［5］。本研究提示人參皂甙20（R）－Rg3能顯著降低U87細胞p－Akt蛋白的表達，而對t－Akt蛋白幾乎無任何影響。結(jié)果提示人參皂甙20（R）－Rg3可能是通過抑制人膠質(zhì)瘤細胞Akt的活化，抑制腫瘤細胞的生長。有研究［6］發(fā)現(xiàn)Bcl－2家族可能是PI3K／Akt通路下游的重要介導者，Akt能負性調(diào)節(jié)促凋亡的Bcl－2家族成員。Bcl－2家族分為抑制凋亡和促進凋亡蛋白兩類，促凋亡因子如Bad、Bax和Bak等，抗凋亡因子如Bcl－2和 Bcl－xL。其中Bax和Bcl－2在凋亡發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用［7］。Bax和 Bcl－2具有拮抗性，它們可以以同源或異源二聚體形式存在，Bcl－2增加時，Bcl－2／Bax比值增加，細胞則趨于存活，反之細胞則趨向死亡，一般認為Bcl－2／Bax比值決定細胞是否凋亡［8］。通常情況下，Bcl－2基因主要分布在機體永久性細胞、增殖旺盛細胞，而在正常神經(jīng)組織和膠質(zhì)細胞中Bcl－2基因不表達。在膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生及膠質(zhì)細胞瘤組織則常伴隨Bcl－2表達［9］，腫瘤的惡性程度越高，Bcl－2基因表達越強［10］。Bcl－2基因表達強度與凋亡細胞密度成顯著負相關(guān)。研究［11］認為腫瘤細胞中Bax蛋白表達與膠質(zhì)瘤患者的生存率密切相關(guān)。本研究采用Western Blot技術(shù)定量分析了人參皂甙20（R）－Rg3對 U87細胞中Bcl－2及Bax蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rg3能顯著降低U87細胞中Bcl－2蛋白的表達，而升高Bax蛋白的表達，同時Bcl－2／Bax比值隨著Rg3濃度的升高而增大。研究［12］發(fā)現(xiàn)人參皂苷 Rg3與 Bcl－2和Bcl－xL有很高的結(jié)合力。Park等［13］研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3可以刺激肝細胞線粒體細胞色素酶釋放，激活caspase－3和Bax蛋白，抑制Bcl－2蛋白表達，通過直接激活線粒體途徑誘導肝細胞凋亡，與本研究結(jié)果相似。上述結(jié)果提示人參皂甙20（R）－Rg3通過改變Bcl－2及Bax蛋白表達，實現(xiàn)對人膠質(zhì)瘤U87細胞的凋亡調(diào)控。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Rg3可能通過抑制PI3K／Akt信號轉(zhuǎn)導通路中的Akt的磷酸化，降低腫瘤細胞抗凋亡蛋白Bcl－2表達，而調(diào)高促凋亡蛋白Bax的表達，進而調(diào)控人膠質(zhì)瘤U87細胞的凋亡。

［1］Agarwal S，Manchanda P，Vogelbaum MA，et al.Function of the blood－brain barrier and restriction of drug delivery to invasive glioma cells：findings in an orthotopic rat xenograft model of glioma［J］.Drug Metabolism and Disposition，2013，41（1）：33－39.

［2］Sin S，Kim SY，Kim SS.Chronic treatment with ginsenoside Rg3induces Akt－dependent senescence in human glioma cells［J］.International Journal of Oncology，2012，41（5）：1669－1674.

［3］Song G，Ouyang G，Bao S.The activation of Akt／PKB signaling pathway and cell survival［J］.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2005，9（1）：59－71.

［4］Rajasekhar VK，Viale A，Socci ND，et al.Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes［J］.Molecular Cell，2003，12（4）：889－901.

［5］Song T，Wang L，Mo Z，et al.Expression of p－Akt in ovarian serous carcinoma and its association with proliferation and apoptosis［J］.Oncology Letters，2014，7（1）：59－64.

［6］Asnaghi L，Calastretti A，Bevilacqua A，et al.Bcl－2 phosphorylation and apoptosis activated by damaged microtubules require mTOR and are regulated by Akt［J］.Oncogene，2004，23（34）：5781－5791.

［7］Karmakar S，Banik NL，Patel SJ，et al.5－Aminolevulinic acid－based photodynamic therapy suppressed survival factors and activated proteases for apoptosis in human glioblastoma U87MG cells［J］.Neuroscience Letters，2007，415（3）：242－247.

［8］Yang E，Korsmeyer SJ.Molecular thanatopsis：a discourse on the Bcl2family and cell death［J］.Blood，1996，88（2）：386－401.

［9］Gomez M，Lianga P，F(xiàn)ueyo J，et al.Transfer of E2F－1to human glioma cells results in transcriptional up－regulation of Bcl－2［J］.Cancer Res，2001，61（18）：6693－6697.

［10］McDonald FE，Ironside JW，Gregor A，et al.The prognostic influence of Bcl－2in malignant glioma［J］.British Journal of Cancer，2002，86（12）：1899－1904.

［11］Cartron PF，Oliver L，Martin S，et al.The expression of a new variant of the pro－apoptotic molecule Bax，Baxpsi，is correlated with an increased survival of glioblastoma multiforme patients［J］.Hum Mol Genet，2002，11（6）：675－687.

［12］Sathishkumar N，Sathiyamoorthy S，Ramya M，et al.Molecular docking studies of anti－apoptotic BCL－2，BCL－XL，and MCL－1proteins with ginsenosides from Panax ginseng［J］.Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry，2012，27（5）：685－692.

［13］Park HM，Kim SJ，Kim JS，et al.Reactive oxygen species mediated ginsenoside Rg3－and Rh2－induced apoptosis in hepatoma cells through mitochondrial signaling pathways［J］.Food and Chemical Toxicology，2012，50（8）：2736－2741.