陳國(guó)梁

(金華市人民醫(yī)院，浙江 金華 321000)

樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是人體中功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，可對(duì)抗原進(jìn)行高效攝取、加工以及呈遞。甲胎蛋白(AFP)屬糖蛋白，源于胚胎肝臟細(xì)胞，待胎兒出生兩周后逐漸從血液中消失。最近有研究顯示原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)甲胎蛋白含量普遍較高，因此眾多科研工作者開(kāi)始考慮甲胎蛋白用于肝癌患者進(jìn)行生物治療。本研究采用甲胎蛋白修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)抗肝癌免疫，實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，現(xiàn)報(bào)道如下。

一、材料與方法

(一)AFP修飾DC細(xì)胞的制備。

人肝癌細(xì)胞株BeL-7402購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，將其制備為熱休克腫瘤細(xì)胞(Bel-7402)凍融抗原。選擇12例健康志愿者，年齡為21-43歲，平均年齡為(31.8±4.2)歲，均抽取其外周血 50-100mL，分別將其單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離，采用10%的胎牛血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)置為37℃，含5%CO2貼壁2h之后，洗去非貼壁淋巴細(xì)胞，采用 GM-CSF(1000U/ml)和 IL-4(500U/ml)將其誘導(dǎo)為未成熟的DC，培養(yǎng)至第6天，將其分為兩組，對(duì)照組僅采用原先的GM-CSF和IL-4繼續(xù)培養(yǎng)，而觀察組加入AFP(甲胎蛋白)陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞株Bel-7402，即采用凍融抗原負(fù)載誘導(dǎo)。兩組均在誘導(dǎo)24h之后采集DCs，采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行分析，采用熒光標(biāo)記觀察CD80、CD86以及HLA-DR等的表達(dá)情況。

(二)成熟DC誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化檢測(cè)。

對(duì)成熟DCs刺激 T淋巴細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)，采用ELISPOT試劑盒，對(duì)照組將誘導(dǎo)成熟DCs刺激誘導(dǎo)T細(xì)胞，而觀察組將AFP陽(yáng)性的凍融抗原誘導(dǎo)成熟DCs去刺激誘導(dǎo)T細(xì)胞。兩組均在37℃和5%CO2中孵育24-48h，之后觀察釋放IFN-γ的激活T細(xì)胞數(shù)。

(三)成熟DC體外誘導(dǎo)特異性肝癌CTLs的檢測(cè)。

選擇12例HLA-A2陽(yáng)性志愿者提取出的自體非貼壁細(xì)胞淋巴細(xì)胞作為目標(biāo)效應(yīng)細(xì)胞，按照1 10比例各加入對(duì)照組和觀察組誘導(dǎo)成功的成熟 DCs，培養(yǎng)5天后收獲，采用DimerX技術(shù)觀察兩組細(xì)胞中特異性抗肝癌CTLs的百分率。

(四)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用(±s)來(lái)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié) 果

本研究結(jié)果顯示觀察組誘導(dǎo)的 DCs成熟表型中CD80、CD86和HLA-DR的比率均顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.16、4.66、15.89，P ＜0.05)(見(jiàn)表 1)。

表1 觀察組和對(duì)照組的DCs成熟表型比率(%，±s，n=12)

表1 觀察組和對(duì)照組的DCs成熟表型比率(%，±s，n=12)

CD80 CD86 HLA-DR對(duì)照組組別05 8.19±4.13 54.29±5.12 23.22±4.52觀察組 32.33±7.12 65.16±6.25 58.24±6.15 t值 10.16 4.66 15.89 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.

ELISPOT檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組中平均每105個(gè)T淋巴細(xì)胞可檢測(cè)到的分泌 IFN-γ的斑點(diǎn)數(shù)為(11.25±2.33)個(gè)，顯著低于觀察組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=36.85，P＜0.05)。

本研究結(jié)果表明，觀察組中誘導(dǎo)CTLs結(jié)合表位肽A和表位肽B的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.58、12.54，P ＜ 0.05)(見(jiàn)表3)。

表2 兩組成熟DCs激活T細(xì)胞釋放IFN-γ的ELISPOT分析(個(gè)，±s)

表2 兩組成熟DCs激活T細(xì)胞釋放IFN-γ的ELISPOT分析(個(gè)，±s)

組別 份數(shù) 斑點(diǎn)數(shù)對(duì)照組12 11.25±2.33觀察組 12 101.62±8.17 t值 36.85 P 值 ＜0.05

表3 兩組成熟DCs誘導(dǎo)CTLs的表位肽-DimerX的檢測(cè)結(jié)果(%，±s)

表3 兩組成熟DCs誘導(dǎo)CTLs的表位肽-DimerX的檢測(cè)結(jié)果(%，±s)

組別 例數(shù) 表位肽A:DimerX 表位肽B:DimerX對(duì)照組 12 0.05±0.02 0.05±0.01觀察組 12 1.06±0.21 1.10±0.29 t值 16.58 12.54 P值 ＜0.05 ＜0.05

三、討 論

目前手術(shù)切除治療肝癌較為徹底，但手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率高，尤以肝內(nèi)復(fù)發(fā)最為顯著。即使術(shù)后采取化療措施，復(fù)發(fā)率仍不可小覷。DC屬抗原呈遞細(xì)胞，未成熟時(shí)遷移能力較強(qiáng)，而成熟后可激活初始T細(xì)胞，維持正常免疫應(yīng)答。體內(nèi)多數(shù)DC處于非成熟狀態(tài)，受抗原刺激后即分化為成熟DC，表達(dá)出高水平的粘附因子[1]。目前針對(duì)于 DC的抗腫瘤免疫治療潛力較大，已用于治療黑色素瘤、腎細(xì)胞瘤和前列腺癌等[2-3]。甲胎蛋白是一種胚性糖蛋白，正常人體內(nèi) AFP水平很低，但出現(xiàn)肝再生、妊娠、生殖系統(tǒng)癌變或者原發(fā)性肝癌時(shí)多數(shù)患者血清中AFP水平均升高，尤其是原發(fā)性肝癌患者，其AFP值升高者大約占80%左右。因此甲胎蛋白是診斷原發(fā)性肝癌的特異性指標(biāo)。

本文表明甲胎蛋白修飾的DCs成熟表型中CD80、CD86和HLA-DR所占比率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，說(shuō)明甲胎蛋白抗原誘導(dǎo)促使DC成熟，增強(qiáng)其呈遞抗原功能。ELISPOT檢測(cè)結(jié)果顯示，甲胎蛋白修飾的成熟DC誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞，平均每105個(gè)T淋巴細(xì)胞可檢測(cè)出分泌IFN-γ的斑點(diǎn)數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。這是由于成熟 DCs表面有較多HSP受體，該受體能夠與T淋巴細(xì)胞相互作用，上調(diào)表面分子表達(dá)，提高IFN-γ分泌。本研究還發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白修飾的成熟DCs誘導(dǎo)CTLs結(jié)合表位肽A和表位肽B的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，表明甲胎蛋白修飾的成熟DCs可激發(fā)特異性抗肝癌免疫應(yīng)答。綜上所述，甲胎蛋白修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)抗肝癌免疫中療效較好，值得臨床推廣。

[1]史繼靜，王 昕，常瑞霞，等.腫瘤抗原特異性CTL細(xì)胞聯(lián)合樹(shù)突狀細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌的安全性和有效性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊，2013，40(24):93-95.

[2]岳玲玲，張連生，柴 曄，等.負(fù)載抗原的DC與CIK共培養(yǎng)對(duì)耐藥乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2012，19(4):437-441.

[3]章 燁，朱壽興，申小蘇，等.多肽負(fù)載DC聯(lián)合CIK治療激素難治性前列腺癌的療效[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2012，19(4):414-420.