楊海平 杜蕾蕾 曾榮 段志敏 沈永年 胡素泉 劉維達(dá) 陳青 李岷

白念珠菌對人THP-1細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素6、活化信號分子IκBα的影響

楊海平 杜蕾蕾 曾榮 段志敏 沈永年 胡素泉 劉維達(dá) 陳青 李岷

目的探討白念珠菌對人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系（THP-1細(xì)胞系）分泌白細(xì)胞介素6（IL-6）和細(xì)胞內(nèi)信號分子NF-κB抑制蛋白（IκBα）激活的影響。方法實時熒光定量PCR分析105、106CFU/ml滅活白念珠菌刺激THP-1細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)水平變化，酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-6分泌量。免疫印跡法分析白念珠菌體外作用THP-1細(xì)胞后不同時間IκBα和磷酸化IκBα的水平。結(jié)果105CFU/ml白念珠菌刺激THP-1 細(xì)胞后 1、3、6 h，IL-6 mRNA 水平（2-ΔΔCt）分別為 1.48 ± 0.06、6.48 ± 0.30、125.34 ± 1.47，刺激 3 h、6 h 后明顯高于空白對照組（P＜0.001）。106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1細(xì)胞后1、3、6 h，IL-6 mRNA水平分別為2.96± 0.35、8.57± 1.27、588.10± 2.31，與空白對照組比較，P值分別為0.036、0.001、 ＜ 0.001。106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1細(xì)胞后24 h，IL-6蛋白水平為（924.9±30.13）ng/L，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。106CFU/ml白念珠菌作用THP-1細(xì)胞后30 min、60 min,磷酸化IκBα蛋白水平顯著升高，而IκBα蛋白水平相應(yīng)降低。結(jié)論人THP-1細(xì)胞體外與白念珠菌作用后激活信號分子NF-κB并分泌IL-6，參與抗念珠菌感染固有免疫反應(yīng)。

念珠菌，白色；白血病，單核細(xì)胞，急性；白細(xì)胞介素6；I-κB蛋白質(zhì)類；NF-κB

白念珠菌是引起淺部、深部念珠菌病的最常見病原真菌。侵襲性念珠菌病是院內(nèi)真菌感染最主要的死因，而白念珠菌是最常見的致病念

珠菌［1］。宿主單核巨噬細(xì)胞作為固有免疫中重要反應(yīng)細(xì)胞，能識別并清除入侵的白念珠菌［2］。本研究旨在探討白念珠菌能否激活人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系細(xì)胞（THP-1）的信號分子 NF-κB抑制蛋白（IκBα），誘導(dǎo)白細(xì)胞介素6（IL-6）的分泌。

材料和方法

1.細(xì)胞、菌株、主要試劑：白念珠菌由中國微生物菌種保藏管理委員會醫(yī)學(xué)真菌中心提供，56℃30 min水浴滅活后，配制成不同濃度菌懸液待用。人THP-1細(xì)胞株購自美國American Type Culture Collection（ATCC）。兔抗人 IκBα 和磷酸化 IκBα 抗體為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。IL-6酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒為欣博盛公司產(chǎn)品。PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。iTaq Universal SYBR Green Supermix為美國Bio-rad公司產(chǎn)品。巴豆酯（PMA）、脂多糖（LPS）為美國Sigma公司產(chǎn)品。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：人THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。將細(xì)胞制備成105/ml細(xì)胞懸液，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔1 ml及6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔2 ml，加入100 μg/L PMA刺激48 h后，予不同濃度白念珠菌共培養(yǎng)。

3.實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR：終濃度為105CFU/ml和106CFU/ml白念珠菌與2×105/ml THP-1共孵育，并設(shè)陽性刺激物 LPS（100 μg/L）組、培養(yǎng)基空白對照組。TRIzol法抽提總RNA，按PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ABI 7300 PCR儀，采用Syber green法對目的基因進(jìn)行擴增。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的變化水平，ΔCt=目的基因-內(nèi)參照（β肌動蛋白）；某一樣品的ΔΔCt=某一樣品ΔCt-對照組樣品的ΔCt。相關(guān)基因引物見表1。

4.Western印跡分析：白念珠菌懸液（106CFU/ml）作用的THP-1細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取總蛋白。等量蛋白的不同樣品梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。5%BSA封閉2 h，兔抗人單克隆抗體4℃孵育過夜。TBST液洗膜3次后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG第二抗體反應(yīng)2 h，TBST液洗膜3次，Supersignal試劑顯色發(fā)光，檢測IκBα和磷酸化IκBα的水平。

表1 實驗所用引物序列

表2 白念珠菌對人THP-1細(xì)胞株白細(xì)胞介素6 mRNA水平的影響

5.ELISA法：刺激THP-1細(xì)胞后24 h，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測IL-6含量。

結(jié) 果

1.白念珠菌對IL-6 mRNA水平的影響：刺激后1、3和6 h，不同濃度白念珠菌組、LPS組、空白對照組的IL-6 mRNA水平的變化情況的見表2。105CFU/ml白念珠菌刺激THP-1細(xì)胞后3、6 h，IL-6 mRNA水平明顯高于空白對照組（P＜0.001）。106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1細(xì)胞后1、3、6 h，IL-6 mRNA水平與空白對照組比較，P值分別為0.036、0.001、＜0.001。

2.白念珠菌對IL-6蛋白分泌的影響：根據(jù)實時定量PCR結(jié)果，選取白念珠菌刺激效果較好的濃度106CFU/ml刺激后24 h，白念珠菌組、LPS組、空白對照組的上清液中IL-6濃度的分別為（924.90±30.13）、（286.10± 6.12）、（10.47±0.07）ng/L， 白念珠菌組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

圖1 免疫印跡法分析白念珠菌體外作用THP-1細(xì)胞后不同時間IκBα和磷酸化IκBα的水平 1：空白對照組；2：作用30 min；3：作用 60 min

3.白念珠菌對THP-1細(xì)胞IκBα激活的影響：刺激后30 min，磷酸化IκBα蛋白水平已有升高，60 min時磷酸化IκBα蛋白水平顯著升高；IκBα蛋白水平則相應(yīng)有所降低。提示白念珠菌能夠激活THP-1細(xì)胞信號分子IκBα。見圖1。

討 論

固有免疫反應(yīng)在抗白念珠菌感染中發(fā)揮重要作用，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞作為主要的固有免疫細(xì)胞，構(gòu)成抗感染免疫反應(yīng)的第一道防線［3-4］。IL-6為主要的前炎癥因子之一，可由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種骨髓來源的免疫細(xì)胞以及各種上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，在抗感染炎癥反應(yīng)的早期階段通過誘導(dǎo)產(chǎn)生急性時相反應(yīng)蛋白來發(fā)揮重要作用；在炎癥后期，可招募單核、巨噬細(xì)胞聚集至感染局部，并能促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡以避免其過度分泌各種活性酶導(dǎo)致的組織損傷［5-7］。

早期研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，IL-6基因缺陷小鼠對系統(tǒng)性或經(jīng)消化道感染的白念珠菌更為敏感，中性粒細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)低于正常小鼠，感染后其數(shù)量也未增多。IL-6缺失會引起念珠菌感染小鼠出現(xiàn)先天性防御反應(yīng)缺陷，如中性粒細(xì)胞功能減低以及產(chǎn)生IL-10對巨噬細(xì)胞活性的抑制效應(yīng)，這一系列反應(yīng)最終導(dǎo)致IL-6缺陷小鼠不能產(chǎn)生Th1型保護(hù)反應(yīng)，出現(xiàn)以IL-10高表達(dá)為特征的Th2型損傷性免疫反應(yīng)［8］。

本研究初步發(fā)現(xiàn)，105、106CFU/ml白念珠菌作用THP-1細(xì)胞后，上調(diào)IL-6 mRNA水平均出現(xiàn)時間依賴效應(yīng)，在刺激后3 h出現(xiàn)上升，刺激后6 h，105CFU/ml白念珠菌組mRNA水平為3 h的19倍，106CFU/ml組則升高59倍。本研究采用LPS（TLR4受體的配體）作為激活THP-1細(xì)胞的陽性對照物，也能誘導(dǎo)出相同的時間依賴效應(yīng)，刺激6 h后IL-6 mRNA水平比3 h組上升77倍。

刺激后3 h，105CFU/ml組IL-6 mRNA水平為6.48± 0.30，106CFU/ml組為 8.57± 1.27，后者為前者的1.32倍。刺激后6 h，兩組分別為125.34±1.47和588.10±2.31，高濃度白念組為低濃度組的4.7倍，提示白念珠菌上調(diào)IL-6 mRNA水平為劑量依賴效應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，106CFU/ml作用THP-1細(xì)胞24 h后，上清液中IL-6含量為（924.90±30.13）ng/L，與空白對照組（10.47±0.07 ng/L）比較，明顯上升，表明白念珠菌不僅能在mRNA水平誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞上調(diào)IL-6轉(zhuǎn)錄，而且在蛋白水平增強該因子的分泌。

NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控前炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)中起重要作用，在無外界刺激因素時，該因子主要由p50和p65亞單位組成，與NF-κB抑制蛋白（IκBα）結(jié)合成復(fù)合體，在細(xì)胞質(zhì)中處于失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞接受適宜刺激后，IκB激酶復(fù)合體可使IκBα 磷酸化和降解， 導(dǎo)致 NF-κB p50、p65二聚體與IκBα解離，該二聚體隨后移位入核，結(jié)合到NF-κB特異的DNA結(jié)合位點，從而調(diào)控相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)［9-10］。本實驗結(jié)果表明，白念珠菌刺激后30 min已出現(xiàn)IκBα蛋白磷酸化，60 min時IκBα磷酸化水平顯著升高，而對應(yīng)的IκBα水平有所降低，提示白念珠菌可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中作為NF-κB p50、p65二聚體抑制劑的IκBα分子出現(xiàn)活化，其對NF-κB抑制效應(yīng)隨之降低，最終導(dǎo)致后者移位入核，調(diào)節(jié)IL-6等前炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。

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2014-01-26）

（本文編輯：顏艷）

Effect ofCandida albicanson the production of interleukin-6 by and activation of IκBα in human THP-1 monocytes

Yang Haiping*,Du Leilei,Zeng Rong,Duan Zhimin,Shen Yongnian,Hu Suquan,Liu Weida,Chen Qing,Li Min.*454th Hospital of PLA,Nanjing 210002,China

s；Li Min,Email；drlimin@sina.cn；Chen Qing, Email；qngchen@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect ofCandida albicanson the production of interleukin-6 by and activation of IκBα in an acute monocytic leukemia cell line THP-1.MethodsTHP-1 cells were classified into three groups to be stimulated by heat-killedC.albicanscells in concentrations of 105and 106colony-forming units（CFU）/ml and lipopolysaccharide （100 μg/L） in vitrorespectively.Those remaining untreated served as the blank control group.After additional culture for different durations,real time reverse transcription PCR and enzyme-linked immunosorbent assay were performed to measure the mRNA and protein expression levels of interleukin-6（IL-6）respectively,and Western blot was conducted to determine the levels of total and phosphorylated IκBα.Statistical analysis was carried out byttest.ResultsA significant increase was observed in the mRNA expression level（2-ΔΔCt）of IL-6 in THP-1 cells at 3 and 6 hours after starting treatment withC.albicansat 105CFU/ml（6.48±0.30 vs.0.84±0.16,125.34±1.47 vs.1.22±0.22,bothP＜0.01）,and at 1,3 and 6 hours after starting treatment withC.albicans at 106CFU/ml（2.96±0.35 vs.1.03±0.16,8.57±1.27 vs.0.84±0.16,588.10±2.31 vs.1.22±0.22,P＜0.05 or 0.01）compared with the blank control group,but no significant difference was noted between THP-1 cells at 1 hour after starting treatment withC.albicansat 105CFU/ml and those remaining untreated（1.48±0.06 vs.1.03±0.16,P ＞ 0.05）.The protein expression level of IL-6 was （924.9 ± 30.13） ng/L in THP-1 cells at 24 hours after starting treatment withC.albicansat 106CFU/ml,significantly different from that in the blank control group（P＜0.001）.There was a marked elevation in the level of phosphorylated IκBα protein,but an obvious reduction in the level of IκBα protein in THP-1 cells treated withC.albicansat 106CFU/ml for 30 and 60 minutes.ConclusionHuman THP-1 monocytes may play a role in innate immune responses againstC.albicansthrough activation of nuclear factor-κB and production of IL-6.

Candida albicans；Leukemia,monocytic,acute；Interleukin-6；I-kappa B proteins；NF-kappa B

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.010

國家自然科學(xué)基金（81371750、81101734）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2011128）

210002南京，解放軍454醫(yī)院（楊海平）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所、江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點實驗室（杜蕾蕾、曾榮、段志敏、沈永年、胡素泉、劉維達(dá)、李岷）；江蘇省血液中心（陳青）

李岷，Email：drlimin@sina.cn；陳青，Email：qngchen@hotmail.com