項(xiàng)麗慧，林馥茗，孫威江，2，*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建泉州362400)

β-櫻草糖苷酶(β-primeverosidase，6-O-β-D-xylopranosyl-β-D-glucopyranosides)，具有基團(tuán)專一性，特異性水解β-櫻草糖苷。對(duì)茶葉而言，其主要作用是通過水解萜醇類糖苷香氣前體，使茶葉呈現(xiàn)出天然花香，并且在茶葉的防御機(jī)制中起到一定的積極效應(yīng)。

早在 1925 年，Bridel M［1］在報(bào)春花 (Primula officinalis)上發(fā)現(xiàn)了β-櫻草糖苷酶具有水解β-櫻草糖苷的作用。之后，Guo W等［2］從茶樹葉片中分離β-櫻草糖苷酶，并提出該酶對(duì)紅茶和烏龍茶香氣有影響。在梔子花中，也有檢測(cè)出β-櫻草糖苷酶的活性［3］。在許多植物中，色素、藥理成分等生理活性物質(zhì)均以β-櫻草糖苷的形式存在，如海巴戟天［4］、杜仲［5］、蘋果［6］、白土茯苓［7］等植物。Plouvier［8］研究認(rèn)為，β-櫻草糖苷酶主要存在于含有β-櫻草糖苷的高等植物體內(nèi)。由于β-櫻草糖苷在植物體內(nèi)可穩(wěn)定存在，越來越多的β-櫻草糖苷被檢出，可推斷β-櫻草糖苷酶在植物體中分布較為廣泛，但由于在其他植物中β-櫻草糖苷酶的功能不顯著或突出，對(duì)β-櫻草糖苷酶的研究暫局限于茶樹和相關(guān)深加工行業(yè)。

在茶葉醇類糖苷水解途徑［9］中，起到關(guān)鍵作用的糖苷類酶主要為β-櫻草糖苷酶、β-葡萄糖苷酶以及β-半乳糖苷酶［10-11］，相比 β-櫻草糖苷酶，其他酶的研究報(bào)道較多［12-16］。β-櫻草糖苷酶對(duì)茶葉的香氣機(jī)理、抗病防御體系、食品加工、化工、制藥有著重要實(shí)際意義，因此本文對(duì)β-櫻草糖苷酶酶學(xué)特性、提取純化方法、活性測(cè)定方法、分子生物學(xué)及其底物種類和變化規(guī)律等方面進(jìn)行綜述，并探討了今后β-櫻草糖苷酶的應(yīng)用前景。

1 β-櫻草糖苷酶

β-櫻草糖苷酶，分子量 61ku，等電點(diǎn) 9.4，當(dāng)pH5～7、溫度50℃以下時(shí)酶活性穩(wěn)定，最適 pH為5.0，溫度 50℃時(shí)活性最高［17］。

1.1 專一性

一般而言，糖苷酶對(duì)糖苷配基的特異性比對(duì)糖殘基的特異性差，β-櫻草糖苷酶也是如此，表現(xiàn)為基團(tuán)專一性，對(duì)苷鍵與糖基的立體結(jié)構(gòu)有很強(qiáng)的特異性。Guo W等［18］研究發(fā)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶對(duì)(S)-芳樟醇-β-櫻草糖苷、苯甲醇-β-櫻草糖苷、苯甲醇-6-O-β-D-呋喃芹菜糖基-β-D-葡萄吡喃糖苷水解活性很高，對(duì)(R)-芳樟醇-β-二糖苷、香葉醇-6-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基-β-二糖苷-D-葡萄吡喃糖苷水解活性低。Matsumura S［19］以銀鹽法合成的β-櫻草糖苷、甾菜糖苷為底物研究了β-櫻草糖苷酶的專一性，認(rèn)為它對(duì)配糖體和糖基均具有嚴(yán)格的特異性。Ijima Y等［20］以從茶葉中提取的雙糖苷為底物分別與β-櫻草糖苷酶進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶的底物專一性是對(duì)含有1-6糖苷鍵的櫻草糖苷的相對(duì)專一性，這與 Matsumura S的觀點(diǎn)不同。Wei-Wei Han等［21］利用β-葡萄糖苷酶的已知結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了β-櫻草糖苷酶的3D模型，并且找到了結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)只有β-櫻草糖苷可與其對(duì)接。以上研究中，早期均是通過水解反應(yīng)結(jié)果作為依據(jù)，判斷β-櫻草糖苷酶的專一性，而Wei-Wei Han從分子動(dòng)力學(xué)角度印證了β-櫻草糖苷酶的基團(tuán)專一性。

1.2 底物

1.2.1 β-櫻草糖苷的分布 β-櫻草糖苷作為茶葉的重要香氣前體物質(zhì)，受到人們極大的關(guān)注。1993年，Guo W 等［22］證實(shí)香葉醇在茶葉中主要以香葉醇-β-D-櫻草糖苷形式存在，芳樟醇主要以芳樟醇-β-D-櫻草糖苷的形式存在，驗(yàn)證了茶樹中不單有葡萄糖苷，還有β-櫻草糖苷的存在。Wang D等［23］合成了26多種糖苷，采用三氟乙酰化衍生方法結(jié)合GC-MS對(duì)茶葉中的糖苷進(jìn)行定性和定量的分析，發(fā)現(xiàn)茶葉中存在11種β-櫻草糖苷和10種β-葡萄糖苷，并且鮮葉中β-櫻草糖苷的含量是β-葡萄糖苷的3倍。近年，采用Amberlite XAD-2作為填料進(jìn)行柱層析分離茶葉 β-櫻草糖苷，Yano M 等［24-31］陸續(xù)分離了藪北種、毛蟹、水仙、櫧葉種中的糖苷類香氣前體，結(jié)合GC-MS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)順-3-己烯醇、芳樟醇及其氧化物(Ⅰ、Ⅱ)、香葉醇、水楊酸甲酯、苯甲醇和2-苯乙醇為茶葉中主要苷元，除了苯甲醇，其余均以β-櫻草糖苷形式存在，只有順-3-己烯醇和苯甲醇存在β-葡萄糖苷，這與Wang D等［23］的研究結(jié)果不同。由以上研究結(jié)果可看出，較β-葡萄糖苷而言，結(jié)合在β-櫻草糖苷的苷元更多，說明β-櫻草糖苷在茶樹中是更為重要的前體物質(zhì)。

1.2.2 在茶葉中的變化規(guī)律 對(duì)不同季節(jié)、不同加工過程的茶樹鮮葉中糖苷類香氣前體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)各種前體在苷元組成上是一致［32-34］。張正竹等［32］研究發(fā)現(xiàn)，櫧葉種春茶的香葉醇糖苷的含量很高，秋茶的芳香族醇和脂肪族醇糖苷含量明顯增長(zhǎng)，但單萜烯醇糖苷含量下降。由此可看出，鮮葉的糖苷類香氣前體物質(zhì)是成品茶香氣的季節(jié)差異性成因之一。Wang D等［33］發(fā)現(xiàn)在紅茶揉捻工序中 β-櫻草糖苷明顯減少，經(jīng)發(fā)酵工序后幾乎完全消失，而葡萄糖苷含量保持不變，說明β-櫻草糖苷是紅茶香氣主要前體物質(zhì)，但與紅茶加工不同的是，在烏龍茶曬青過程中，大多數(shù)糖苷含量上升，成茶的糖苷達(dá)到最高水平［34］。這有可能是二者加工過程中環(huán)境溫濕度以及工藝不同而導(dǎo)致，具體原因有待深入研究。

2 提取純化及酶活測(cè)定方法

經(jīng)提取純化后，可獲得較高純度的β-櫻草糖苷酶，使β-櫻草糖苷酶具有最大的催化活性。Ogawa K等［35］將茶鮮葉經(jīng)勻漿處理制成丙酮粉，用40%～80%的硫酸銨沉淀酶蛋白，經(jīng)透析后，用CM-TOyopearl 650M柱層析，得到糖苷酶三個(gè)組分，其中Ⅱ組分組經(jīng)膜超濾脫鹽濃縮，再使用單SHR5/5離子交換柱進(jìn)行快速蛋白液相色譜分離，得到Ⅱ1、Ⅱ2兩個(gè)組分，Ⅱ1經(jīng)凝膠色譜和SDS-PAGE分析，即為純化后的β-櫻草糖苷酶。現(xiàn)階段的提取純化方法多僅限于實(shí)驗(yàn)室的操作，為今后實(shí)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶的工業(yè)化發(fā)展，日本天野酶株式會(huì)社［36］獲得與β-櫻草糖苷酶有著相似功能的二糖苷酶(來自青霉(Pencicillium)以及相應(yīng)的基因，該新型二糖苷酶分子量(40±5)ku，最適pH為4.5、等電點(diǎn)4.3。該酶可水解包括櫻草苷在內(nèi)的類似二糖糖苷，相較從煙曲霉產(chǎn)生的二糖苷酶，安全性高，酶活性高，耐熱性好，在各種食品、藥品、準(zhǔn)藥品領(lǐng)域可廣泛應(yīng)用。

β-櫻草糖苷酶的活力表現(xiàn)為催化水解反應(yīng)的速度，酶催化的反應(yīng)速度可以用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的積累量來表示。測(cè)定β-櫻草糖苷酶活性主要采用色原底物法，由于市面上暫無4-甲基傘形糖基β-櫻草糖苷或pNP-β-櫻草糖苷出售，需在木糖苷酶的催化下通過轉(zhuǎn)糖基作用合成。Ma S J等［37-38］將木糖和pNP-葡萄糖苷合成的pNP-β-櫻草糖苷，作為β-櫻草糖苷酶反應(yīng)底物，采用pNP(對(duì)硝基苯酚)法對(duì)β-櫻草糖苷酶活性進(jìn)行測(cè)定。董尚勝、童啟慶［3］用木糖和4-甲基傘形酮β-葡萄糖苷制成4-甲基傘形酮β-櫻草糖苷(4-MUβ-Pri)，通過4-MU法(檢測(cè)波長(zhǎng)為448nm)測(cè)定梔子花的β-櫻草糖苷酶的活性。目前β-櫻草糖苷酶活的測(cè)定方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，致使不同實(shí)驗(yàn)得到β-櫻草糖苷酶酶活無法進(jìn)行比較分析，需盡快確立科學(xué)的方法。

3 分子生物學(xué)研究

基因工程技術(shù)可讓人們有可能生產(chǎn)出大量的β-櫻草糖苷酶，以研究其特性，并應(yīng)用于食品工業(yè)。2002年 Mizutani等［17］根據(jù)藪北中純化到的 β-櫻草糖苷酶的部分氨基酸序列，獲得了編碼β-櫻草糖苷酶的cDNA克隆(序列號(hào):AB088027)，全長(zhǎng)1729bp，編碼507個(gè)氨基酸(28個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽和479個(gè)氨基酸殘基的成熟蛋白質(zhì))，與多種植物上的β-葡糖苷酶存在50%～60%同源性。費(fèi)月［39］將β-櫻草糖苷酶的ORF框片段，插入原核表達(dá)載體pET-32a，轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株Rosetta(DE3)pLysS中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白。

根據(jù)已登錄的基因，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，趙麗萍等［40］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明β-櫻草糖苷酶基因在一芽一葉表達(dá)量很低，一芽二葉最高(2.49×106copy·μL-1)，而后隨著成熟度的增加而降低，β-葡萄糖苷酶基因的表達(dá)量明顯高于β-櫻草糖苷酶基因，一芽二葉和一芽三葉新梢中兩個(gè)基因的表達(dá)量均較高，這恰好符合烏龍茶采摘標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證了成品茶花香高低與鮮葉中β-櫻草糖苷酶的表達(dá)有一定相關(guān)性。張廣輝［41］利用RT-PCR和GC-MS研究了UV-B處理對(duì)β-櫻草糖苷酶與β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)和離體茶樹葉片香氣成分的影響，結(jié)果表明短時(shí)間UV-B處理可以刺激糖苷水解酶的基因活性，而使更多的香氣前體被水解并釋放出香氣成分。2014年，Jiang SHI等［42］研究表明，經(jīng)茉莉酸甲酯處理過的龍井43茶樹，葉片中的β-櫻草糖苷酶表達(dá)水平增加3倍，極顯著高于空白對(duì)照。綜上所述，不同葉位、UV-B以及茉莉酸甲酯處理對(duì)β-櫻草糖苷酶表達(dá)量均有所影響，這為研究茶葉香氣形成的分子機(jī)理提供了重要的依據(jù)。

4 在抗病防御體系中的作用

茶樹中的β-櫻草糖苷酶對(duì)茶葉品質(zhì)有影響，同時(shí)在抗病防御體系中也起到重大作用。在β-櫻草糖苷酶催化產(chǎn)生的物質(zhì)中，3-己烯醇分別具有對(duì)害蟲的毒性和吸引害蟲天敵的直接或間接防御作用［43-44］，還有水楊酸甲酯是誘導(dǎo)多種防御反應(yīng)的信號(hào)物質(zhì)［45］。戚麗等的研究結(jié)果顯示，當(dāng)β-櫻草糖苷在濃度為5.0～25.0mg/mL時(shí)，對(duì)茶樹葉部茶炭疽病菌、茶云紋葉枯病菌、茶輪斑病菌和茶赤葉斑病菌均具有明顯的抑制作用，糖苷類香氣前體組分濃度與抗菌活性呈正相關(guān)［46-47］。

綜上，具有抗病防御作用的物質(zhì)是以穩(wěn)定的β-櫻草糖苷形式貯存在茶樹葉片中的，當(dāng)遇到蟲害及病菌侵染時(shí)，在β-櫻草糖苷酶或外源病原菌水解酶的作用下，水解并釋放出苷元，從而抵御外界的侵染。

5 問題與展望

在茶葉加工中，要通過人工施用外源β-櫻草糖苷酶實(shí)現(xiàn)對(duì)香氣品質(zhì)的調(diào)控，難度大，不可控因素多，從分子角度研究茶樹β-櫻草糖苷酶，并運(yùn)用到茶樹育種中，能避免上述難題，同時(shí)還可以選育出抗逆性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)品種。值得關(guān)注的是，由于獲得反應(yīng)底物的難度較大，現(xiàn)今暫無統(tǒng)一的β-櫻草糖苷酶活性的測(cè)定方法，各個(gè)研究組的結(jié)果不盡相同，難以進(jìn)行比較分析，但隨著更快速、準(zhǔn)確的活性測(cè)定方法的確定，并能進(jìn)一步研究在不同環(huán)境條件β-櫻草糖苷酶活和表達(dá)量的變化，尋找酶、香氣物質(zhì)之間的相關(guān)性，這有利于發(fā)現(xiàn)茶葉加工關(guān)鍵控制點(diǎn)，獲得較佳的香氣物質(zhì)組成配比和含量。

目前，人們已基本掌握β-櫻草糖苷酶的酶學(xué)特性，并運(yùn)用基因工程法制備β-櫻草糖苷酶，對(duì)其底物的分布和變化研究也取得了可喜的成果。一方面，β-櫻草糖苷酶可用于調(diào)節(jié)香氣成分的提取效率，如茶飲料、化妝品、香水、調(diào)味料、藥品、木工制品等產(chǎn)品，還能對(duì)植物材料、食物和飲料等的色度起到改善作用。另一方面，β-櫻草糖苷酶水解反應(yīng)的產(chǎn)物——櫻草糖，已從茶葉中分離獲得［48］，可作為糖尿病、肝病患者日常食用的能量來源，同時(shí)具有保濕、抗氧化功能等特點(diǎn)，有望取代海藻糖用于化妝品行業(yè)。隨著β-櫻草糖苷酶、β-櫻草糖苷及櫻草糖的研究進(jìn)展加深加快，將在茶葉加工、食品深加工及化工行業(yè)等得到更廣泛的應(yīng)用。

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