李洪波，郭祥前，陳 靜，龍 騰，張子政

(懷化學(xué)院1.生命科學(xué)系;2.民族藥用植物資源研究與利用湖南重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418008)

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)學(xué)名為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，常用名為乳糖酶，廣泛存在于各種動物、植物、微生物中，可催化乳糖分解成一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖[1，2].利用乳糖酶水解乳制品中的乳糖，可將乳糖含量降低70%-80%，解決乳糖不耐癥患者的乳品消費(fèi)問題[2-4].熱穩(wěn)定性好的β-半乳糖苷酶具有較高的開發(fā)價值，目前多數(shù)耐熱β-半乳糖苷酶的最適溫度在60℃以上，高溫下熱穩(wěn)定性良好，能夠有效降低生產(chǎn)工藝中微生物污染的風(fēng)險[5].嗜熱β-半乳糖苷酶主要來源于高溫菌，已有許多研究報道表明通過基因重組技術(shù)，將嗜熱β-半乳糖苷酶基因?qū)脒m合的宿主細(xì)胞，可以高效地產(chǎn)生熱穩(wěn)定性好的重組β-半乳糖苷酶[6-8].碳源是影響重組蛋白在組成型畢赤酵母中分泌表達(dá)水平的最主要因素.本研究分別以葡萄糖、果糖、丙三醇、乳糖、蔗糖、麥芽糖六種碳源，分析碳源對組成型重組酵母分泌表達(dá)源自嗜熱菌Pyrococcus furiosuβ-半乳糖苷酶的影響，確定組成培養(yǎng)基的最佳碳源.

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)嗜熱菌Pyrococcus furiosuβ-半乳糖苷酶的組成型畢赤酵母轉(zhuǎn)化子由佛羅里達(dá)大學(xué)李侍武教授饋贈，胰蛋白胨及酵母提取物購自O(shè)XIOD公司，YP 液體培養(yǎng)基包含1%酵母提取物和2%蛋白胨(添加1.8%瓊脂即為YP 固體培養(yǎng)基).鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷 (ONPG)、考馬斯亮藍(lán)G-250 及小牛血清(BSA)購自Sigma公司.葡萄糖、丙三醇、果糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖為國產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 碳源對菌體生長速度的影響

將重組酵母轉(zhuǎn)接至含2%葡萄糖的YP 固體培養(yǎng)基平板活化，28℃培養(yǎng)3 d，挑取重組酵母轉(zhuǎn)化子單菌落接種至含2%葡萄糖的YP 液體培養(yǎng)基中，28℃、200 rpm 培養(yǎng)36 h.按2%的接種量分別接至含2%以下6種碳源的YP 液體培養(yǎng)基中:葡萄糖、丙三醇、果糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，28℃、200 rpm 搖床培養(yǎng)4 d，每24 h 取樣一次.測定在λ =600 nm 處測定待測液菌體濃度.設(shè)畢赤酵母出發(fā)菌株在果糖中的培養(yǎng)為對照.

1.2.2 碳源對重組酵母分泌蛋白的影響

分別取在不同碳源條件下的發(fā)酵液上清，以牛血清白蛋白為標(biāo)品，采用Bradford 法測定蛋白濃度，蛋白濃度測定方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[9].

1.2.3 測定相對酶活

采用鄰硝基苯酚法測定酶活，參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[9]，分別取樣品上清100 μL，快速加入1.4 mL 0.25% ONPG溶液，立即搖勻?qū)悠分糜?5℃水浴鍋中水浴3 min.立即加入0.5 mL NaCO3溶液終止反應(yīng).空白對照為加入待測液后先加入NaCO3溶液，后加入ONPG 溶液，同樣水浴3 min 后，以空白為對照，在分光光度計(jì)λ =420 nm 處測定各樣品的OD值.以酵母出發(fā)菌株在2%葡萄糖的YP 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌液上清為對照.

1.2.4 目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE 分析

取不同碳源在不同培養(yǎng)時間下的重組酵母發(fā)酵液上清液TCA 沉淀后，100%乙醇洗滌蛋白沉淀3次，含8 M 尿素的PBS 溶解蛋白沉淀，加入SDS 上樣緩沖液，煮沸熱變性5 min，12% SDS-PAGE 電泳分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對菌體生長速度的影響

不同碳源下菌體生長曲線如圖1所示，丙三醇中的酵母菌體濃度最高，麥芽糖最低.丙三醇中的酵母第1 d 即進(jìn)入對數(shù)期，第2-4 d 維持在穩(wěn)定期，菌體濃度在培養(yǎng)4 d 時為各碳源最高;果糖、葡萄糖及丙三醇的菌體生長曲線趨同.以蔗糖、乳糖及麥芽糖為碳源，培養(yǎng)2 d 內(nèi)處于停滯期，之后進(jìn)入對數(shù)期;以蔗糖為碳源于第3 d 進(jìn)入穩(wěn)定期，以麥芽糖和乳糖為碳源，培養(yǎng)4 d 后仍處于菌體生長的對數(shù)期.菌體生長曲線說明，單糖和丙三醇為碳源，菌體的生長明顯快于雙糖，當(dāng)以乳糖和麥芽糖為碳源時菌體生長的停滯期和以數(shù)生長期最長.出發(fā)菌株在果糖中的生長曲線和菌體濃度與重組酵母在果糖中的情況基本一致.在不同碳源中，重組酵母菌的菌體生長情況是:丙三醇＞果糖＞葡萄糖＞蔗糖＞麥芽糖＞乳糖.

圖1 不同碳源下酵母的菌體生長曲線

2.2 碳源對重組酵母分泌目標(biāo)蛋白的影響

不同碳源培養(yǎng)的培養(yǎng)基上清中的總蛋白濃度如圖2所示，以葡萄糖、果糖和丙三醇為碳源，酵母分泌的總蛋白在第2 d 迅速上升，之后維持在一個相對穩(wěn)定的水平;乳糖在1-2 d 蛋白濃度較低，而3-4 d 總蛋白濃度迅速上升，并與上述3種碳源達(dá)相近水平.以麥芽糖和蔗糖為碳源時，發(fā)酵液中的總蛋白濃度在4 d 內(nèi)均處于較低水平.菌體分泌蛋白的曲線說明，單糖和丙三醇為碳源菌體，發(fā)酵液中的總蛋白濃度較高，重組酵母菌分泌蛋白的能力在3種碳源中相近，當(dāng)以乳糖為碳源，在培養(yǎng)的第4 d 達(dá)到與以上3種碳源接近的水平，當(dāng)以麥芽糖和蔗糖為碳源時在培養(yǎng)時間范圍內(nèi)，重組酵母轉(zhuǎn)化子僅能分泌少量蛋白.

圖2 不同碳源下樣品的總蛋白濃度

2.3 碳源對重組酵母分泌β-半乳糖苷酶酶活的影響

由圖3可知，除畢赤酵母出發(fā)菌株的酶活始終很低外，6種碳源都能使重組酵母分泌β-半乳糖苷酶.在培養(yǎng)的第1 d，葡萄糖為碳源酶活最高，而第2 d 果糖為最高;果糖的酶活在第4 d 有所下降，葡萄糖從3 d 開始，酶活稍有下降;以丙三醇為碳源，在培養(yǎng)的4 d 內(nèi)，酶活一直在增加，但其酶活要低于果糖和葡萄糖.當(dāng)以蔗糖、麥芽糖和乳糖雙糖為碳源時，酶活在培養(yǎng)時間內(nèi)始終處于較低水平，且總體穩(wěn)定，沒有明顯增加.酶活測定結(jié)果表明，果糖是6種碳源中最好的碳源，其次是葡萄糖和丙三醇;蔗糖、麥芽糖和乳糖雙糖在培養(yǎng)重組酵母時，其分泌的β-半乳糖苷酶酶活較低.

圖3 不同碳源下β-半乳糖苷酶的相對酶活力

圖4 不同碳源下目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE 圖譜

2.4 不同碳源對重組酵母分泌目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE 分析

重組嗜熱菌Pyrococcus furiousβ-半乳糖苷酶的分子量大約為60 kDa，出發(fā)菌株以果糖為碳源的蛋白分泌和重組酵母菌株在6種碳源中的蛋白分泌情況的SDS-PAGE 結(jié)果如圖4所示.從SDS-PAGE 結(jié)果可以看出，出發(fā)菌株以果糖為碳源其培養(yǎng)基上清0、1、2、3、4 d 樣品在目標(biāo)位置未出現(xiàn)明顯的特異蛋白條帶;當(dāng)以果糖為碳源時，其培養(yǎng)基上清在培養(yǎng)前沒有特異條帶，在培養(yǎng)的1、2、3、4 d 中，60 kDa 處出現(xiàn)特異蛋白條帶，該條帶在培養(yǎng)的第1 d 就已經(jīng)非常明顯;當(dāng)以葡萄糖為碳源時，其培養(yǎng)基上清在培養(yǎng)前沒有特異條帶，在培養(yǎng)的1、2、3、4 d 中，60 kDa 處出現(xiàn)特異蛋白條帶，該條帶在培養(yǎng)的第1 d 就已經(jīng)較明顯并持續(xù)增加到第4 d;當(dāng)以丙三醇為碳源時，其培養(yǎng)基上清在培養(yǎng)前沒有特異條帶，在培養(yǎng)后，60 kDa 處出現(xiàn)特異蛋白條帶，該條帶在培養(yǎng)的第1 d 就已經(jīng)較明顯并持續(xù)加到第4 d;當(dāng)以蔗糖、麥芽糖和乳糖雙糖為碳源時，60 kDa 處出現(xiàn)特異蛋白條帶，但始終較弱.SDS-PAGE的檢測結(jié)果與酶活測定結(jié)果基本吻合.SDS-PAGE 結(jié)果同樣表明，以單糖和丙三醇為碳源時，β-半乳糖苷酶的分泌不平要明顯高于雙糖.

3 討論

目前，商用乳糖酶以耐熱性較差的胞內(nèi)酶為主，這些胞內(nèi)酶的產(chǎn)率低并且分離純化過程比較復(fù)雜，使得商業(yè)用乳糖酶的市場價格較昂貴.從食品安全性考慮，在乳業(yè)生產(chǎn)上加入低溫酶容易引起污染，存在食品質(zhì)量安全隱患.耐高溫乳糖酶在100℃經(jīng)幾十分鐘甚至數(shù)小時熱處理仍保持很高的活性，并且在高溫條件下，乳糖更易水解.牛乳消毒主要采用巴氏消毒法或高溫瞬時消毒法，耐高溫酶在上述消毒甚至滅菌條件下仍能滿足去除乳糖的要求，耐高溫乳糖酶的產(chǎn)業(yè)化前景廣闊[10-13].本研究主要分析碳源對組成型重組酵母分泌源自嗜熱菌Pyrococcus furiosuβ-半乳糖苷酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組畢赤酵母在不同碳源下分泌表達(dá)重組β-半乳糖苷酶的能力存在明顯差異，并得出6種碳源中果糖為酵母產(chǎn)β-半乳糖苷酶的最佳碳源，葡萄糖、丙三醇次之，且單糖碳源要優(yōu)于雙糖，畢赤酵母生長與β-半乳糖苷酶合成同步，在生長的對數(shù)期酶活力最高.

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