李 妍，李 鋒，許 暉

(1.蚌埠學院 食品與生物工程系，安徽 蚌埠 233030;2.南京軍區(qū)總醫(yī)院 血液科，江蘇 南京 210002)

荷葉系睡蓮科蓮屬植物蓮NeLumbo nuciferaGaertn的干燥葉[1].相關研究表明，荷葉內的黃酮具有調血脂活性，其減肥降脂作用越來越受到人們的重視[2].黃酮類物質具有抗病毒、抗菌、抑制癌細胞等多種藥理活性，對治療心血管等疾病有重要意義[3].然而，多數(shù)黃酮類物質均存在難溶于冷水且不穩(wěn)定的問題，這就使其應用受到限制.微囊化技術改變了物態(tài)、體積和質量;降低了揮發(fā)性并進行控制性釋放;隔離活性成分，保護敏感物質[4-7].本實驗采用啤酒酵母細胞對荷葉總黃酮進行包埋，實現(xiàn)其微膠囊化.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷葉采自蚌埠市懷遠縣;蘆丁標準品(中國生物制品檢定所);95%乙醇(上海振企化學試劑有限公司);酵母浸粉(北京索萊寶科技有限公司);蒸餾水(蚌埠學院實驗室制造);蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、硫酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為國產分析純.

1.2 儀器與設備

722 可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);FA214 電子天平(上海衡器總廠);XFB-200 高速中藥粉碎機(吉首市中誠制藥機械廠);725N 紫外可見光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);HH-1 恒溫水浴鍋 (江蘇省金壇市榮華儀器有限公司);電熱鼓風干燥箱 (上海一恒科學儀器有限公司);離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司);旋轉蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司);THZ-103B 恒溫震蕩培養(yǎng)箱(廣州滬瑞明儀器有限公司);SB-25-12DT 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司).

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制[8，9]

采用NaNO2-Al (NO3)3-NaOH 顯色法.即準確稱取20 mg 蘆丁標準試劑，用50%乙醇溶液定溶至100 mL，搖勻，得濃度為0.2 mg/mL 標準溶液;準確吸取蘆丁標準溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL 于8只25 mL 容量瓶中，然后分別加入1 mL 5% NaNO2，放置6 min，加入1 mL 10% Al (NO3)3，搖勻，放置6 min，加入10 mL 4% NaoH 50%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min 后，在510 nm 處測定其吸光度.以吸光度A 對蘆丁濃度作圖，得標準曲線.

1.3.2 包埋率的計算法[10]

準確稱取荷葉總黃酮的量為M.由于不能直接對包埋的荷葉總黃酮進行測定，故可以通過測定未被包埋的荷葉總黃酮的含量(X)，間接換算出被包埋的荷葉總黃酮的量(M-X).則包埋率為:(M-X)/M.X的測定方法為:將包埋后的懸液測定其在510 nm處的吸光度，再將吸光度代入荷葉總黃酮標準曲線回歸方程中計算出荷葉總黃酮的含量，即為X.

1.3.3 荷葉總黃酮的提取

稱取荷葉1 g，采用80%乙醇濃度，調節(jié)pH值為9，超聲提取時間45 min，抽濾，旋轉蒸發(fā)，真空干燥24 h[2].

1.3.4 荷葉總黃酮微膠囊的制備

酵母細胞經過5次水洗過后，加20倍的5%氯化鈉溶液，置于錐形瓶中，放入54℃，150 r/min 搖床中進行質壁分離24 h，再次4 200 r/min 離心10 min，經5次水洗后，放置-80℃冰箱中冷凍2 h，最后放在冷凍干燥機上干燥24 h.

將荷葉總黃酮和酵母細胞按不同的芯材比加入錐形瓶中，并加入一定體積的蒸餾水，混合均勻后，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中.恒溫恒速振蕩一定時間后，利用滲透擴散作用使荷葉總黃酮可進入酵母細胞內部，從而形成微膠囊.混合溶液在4 200 r/min 離心10 min后，將上層清液緩慢倒出，下層細胞用蒸餾水洗滌，將未包入的荷葉總黃酮除去，冷凍干燥24 h 后，得包埋物.

1.3.5 包埋單因素試驗

1.3.5.1 包埋時間對包埋效果的影響

準確稱取荷葉總黃酮1.00 g，將料液比確定為1∶6，芯材比為1∶3，溫度為40℃，包埋時間分別設為4、5、6、7、8 h.平行3次，按照1.3.4 操作，制備微膠囊.

1.3.5.2 料液比對包埋效果的影響

準確稱取荷葉總黃酮1.00 g，將包埋時間確定為6 h，芯材比為1∶3，溫度為40℃，料液比分別設為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8.平行3次，按照1.3.4操作，制備微膠囊.

1.3.5.3 芯材比對包埋效果的影響

準確稱取荷葉總黃酮1.00 g，將包埋時間確定為6 h，料液比為1∶6 溫度為40℃，芯材比分別設為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5.平行3次，按照1.3.4操作，制備微膠囊.

1.3.5.4 溫度對包埋效果的影響

準確稱取荷葉總黃酮1.00 g，將包埋時間確定為6 h，料液比為1∶6，芯材比為13 溫度分別設為20、30、40、50、60℃.平行3次，按照1.3.4 操作，制備微膠囊.

1.3.6 正交試驗

根據單因素實驗設計正交試驗因素水平表.研究包埋時間 (A)、料液比 (B)、芯材比 (C)和溫度(D)4個因素對荷葉總黃酮微膠囊制備的影響.正交因素水平表見表2-1.

表1 正交試驗因素水平表

1.3.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據以x ±s表示，統(tǒng)計學推斷采用單因素方差分析[10].

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

在波長510 nm 處，測定不同質量濃度的蘆丁標準品溶液在顯色反應后的吸光度值，結果見圖1.由圖1可知，標準曲線回歸方程為A =16.61C-0.0028，相關系數(shù)R2=0.9994，表明二者線性關系良好[10].

2.2 單因素試驗

2.2.1 包埋時間對包埋效果的影響

由圖2可知，隨著包埋時間的延長，荷葉總黃酮的包埋率先增加后減小，在包埋時間6 h 處出現(xiàn)最高點.包埋率并未隨時間的增加而增加，可能是由于過長時間的振蕩，反而阻止微膠囊的形成，而且對荷葉總黃酮微膠囊產生破壞作用.

2.2.2 料液比對包埋效果的影響

圖1 蘆丁標準曲線

由圖3可知，在料液比為1∶7 包埋率隨著料液比的增大而增加，之后料液比增加包埋率反而下降.這種現(xiàn)象表明，過多的溶劑對荷葉總黃酮微膠囊的形成并非有利，反而影響了包埋的效果.

2.2.3 芯材比對包埋效果的影響

由圖4知，在被包埋物質量不變的情況下，不斷地加大壁材酵母細胞的質量，包埋率先穩(wěn)定上升后緩慢下降.造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于隨著壁材的增多，壁材分子之間相互作用，降低了壁材對包埋物的包埋效果，從而導致了包埋率的降低.

圖2 包埋時間對包埋效果的影響

圖3 料液比對包埋效果的影響

2.2.4 溫度對包埋效果的影響

圖4 芯材比對包埋效果的影響

由圖3-4可知荷葉總黃酮微膠囊的包埋率隨著溫度的升高先升高后降低，在50℃處出現(xiàn)最高峰.這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是因為隨著溫度的升高，分子結構遭到破壞了或是水分蒸發(fā)速度太快，導致壁材成膜性降低.結果表明包埋溫度并不是越高越好，而是只有在合適的溫度下包埋效率可達到最高，微膠囊效果最好

圖5 溫度對包埋效果的影響

2.3 正交試驗結果

表2 正交試驗結果

表3 方差分析表

由表2、表3可以得出，各因素的主次為D ＞A ＞B ＞C，最佳組合為A2B2C1D2.即影響荷葉總黃酮微膠囊化的主要因素為:溫度＞包埋時間＞料液比＞芯材比.荷葉總黃酮包埋的最佳條件為:包埋時間6 h，料液比為1∶7，芯材比為1∶2，包埋溫度為50℃，包埋率可達到30.4%.

2.4 驗證試驗

參考最佳微膠囊化條件:包埋時間6 h，料液比為1∶7，芯材比為1∶2，包埋溫度為50℃，共進行3次驗證試驗，測得荷葉總黃酮包埋率分別為30.2%、31.1%和30.4%，平均為(30.4 ±0.17)%，因此采用此包埋優(yōu)化條件參數(shù)準確可靠.

3 討論

本實驗采用啤酒酵母細胞對荷葉總黃酮進行包埋，最佳包埋條件為:包埋時間6 h，料液比為1∶7，芯材比為1∶2，包埋溫度為50℃.由驗證試驗結果顯示在此條件下荷葉總黃酮微膠囊化的包埋率可達到30.4%.本實驗中使用恒溫振蕩培養(yǎng)箱，通過振蕩使荷葉總黃酮微膠囊化的方法遠優(yōu)于文獻報道其它方法，具有一定的應用價值.

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