朱立志 李郭錦 田 鶴 李曉明 郭 敏△

急性腎損傷（acute kidney injury,AKI）是臨床常見癥候群，病死率極高，除AKI外，AKI誘導(dǎo)的腎外器官損傷如急性肝、肺損傷等，也構(gòu)成患者死亡原因[1]。引起AKI的原因多為腎缺血，又稱缺血性急性腎損傷（IAKI）。Caspase依賴的細(xì)胞死亡和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP-1）介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是2種典型的不同形式的細(xì)胞死亡，caspase-3是外源性凋亡的執(zhí)行者[2]，細(xì)胞死亡過程中PARP-1的過度激活可致受損細(xì)胞死亡，又稱PARP-1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[3]。IAKI可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征，如急性尿毒癥性腦病，其機(jī)制不明[4]，原因之一是尚不完全清楚神經(jīng)元對(duì)IAKI的反應(yīng)機(jī)制。海馬是對(duì)外源性刺激，如缺血、游離基等反應(yīng)最為敏感的部位[5]，盡管有學(xué)者通過光鏡觀察了海馬神經(jīng)元對(duì)IAKI的反應(yīng)[6]，但有關(guān)IAKI對(duì)海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響尚鮮見報(bào)道。本研究復(fù)制了IAKI大鼠模型，應(yīng)用光鏡、電鏡、免疫組織化學(xué)及免疫印跡技術(shù)對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行觀察和分析，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。清潔級(jí)SD大鼠12只，8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（遼）2008-0002。飼養(yǎng)于遼寧醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SYXK（遼）2009-0004。（2）主要試劑及儀器。羊抗大鼠PARP-1（Santa Cruz公司）、兔抗大鼠caspase-3單克隆抗體（abcam公司）；二抗試劑盒（辣根酶標(biāo)記抗羊和羊抗兔多聚體、辣根過氧化酶標(biāo)記抗羊和羊抗兔IgG抗體）、β-actin鼠單克隆抗體及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)。LKB-V型超薄切片機(jī)(德國Leica公司)，EX1200透射電鏡(日本電子公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 動(dòng)物以苦味酸編號(hào)，之后按單純隨機(jī)法（按隨機(jī)數(shù)字表）將動(dòng)物分為2組，實(shí)驗(yàn)組（IAKI組）8只，苯巴比妥鈉麻醉后開腹，應(yīng)用無損傷血管夾阻斷雙側(cè)腎動(dòng)脈血流60 min后放開血管夾。對(duì)照組（sham組）4只，手術(shù)過程同前，但不阻斷腎動(dòng)脈血流。2組動(dòng)物關(guān)腹后于無菌條件下飼養(yǎng)24 h后取材。

1.2.2 取材 各組一半動(dòng)物麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血2 mL用于腎功能常規(guī)檢查。然后經(jīng)心室用2.5%多聚甲醛戊二醛灌流固定大腦，經(jīng)200 mL成功灌注（大鼠出現(xiàn)去大腦強(qiáng)直表現(xiàn)）后，取大腦入同樣固定液進(jìn)行浸潤(rùn)固定48 h；另一半動(dòng)物斷頭后迅速切取海馬組織用于免疫印跡測(cè)定分析。

1.2.3 光鏡電鏡標(biāo)本制備 部分多聚甲醛戊二醛固定的腦組織經(jīng)水洗后進(jìn)行系列乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟定向包埋，行7～8 μm厚切片，部分切片蘇木素、伊紅染色，光鏡觀察；部分切片免疫組織化學(xué)染色備用。部分經(jīng)2.5%多聚甲醛戊二醛固定的腦組織再經(jīng)1%鋨酸后固定后，常規(guī)電鏡標(biāo)本制備，樹脂Epon812包埋，LKB-V型超薄切片機(jī)半薄切片，厚1 μm，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡觀察海馬各區(qū)定位后再行超薄切片，厚70 nm，重金屬雙染色，EX1200透射電鏡觀察。

1.2.4 PARP-1和caspase-3免疫組織化學(xué)染色 采用石蠟切片免疫組化Envision法。切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫溶液處理30 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶，高壓修復(fù)抗原，分別滴加稀釋（1∶100）的一抗（PARP-1和caspase-3單克隆抗體）4℃過夜，滴加辣根酶標(biāo)記的抗羊和羊抗兔多聚體（PV6001）37℃孵育30 min，DAB顯色。以上各步驟之間用0.01 mol/L PBS洗滌3次，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。陰性對(duì)照用PBS替代一抗。蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色，PARP-1陽性顆粒分布于細(xì)胞核，caspase-3陽性顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)。

1.2.5 PARP-1和caspase-3免疫印跡檢測(cè) 各組新鮮海馬組織加入RIPA裂解液，0℃下剪碎和超聲波粉碎20 s后靜置30 min，4℃下12 000 r/min離心20 min，留取上清液，BCA法測(cè)定蛋白含量，并按每20 μL含50 μg蛋白制成樣品，-20℃冰箱保存。取已制備樣品適量加入電泳槽，100 V電壓下電泳，轉(zhuǎn)膜，常溫下半干轉(zhuǎn)印，TBST沖洗后，5%小牛血清白蛋白室溫封閉1～2 h。分別加入一抗（PARP-1和caspase-3抗體，稀釋度1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗脫3次，每次5 min；分別加入二抗（辣根過氧化酶標(biāo)記的抗羊和羊抗兔IgG抗體，稀釋度1∶200）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗脫3次，每次5 min，ECL發(fā)光顯色；采用β-actin作為內(nèi)參，掃描電泳條帶，用凝膠分析軟件分析各蛋白目的條帶吸光度。以目的條帶與內(nèi)參條帶吸光度的比值表示待測(cè)蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件分析，計(jì)量資料用x±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能檢測(cè)結(jié)果 IAKI組血尿素氮為（39.1±2.7）mmol/L，血清肌酐為（318±26）mmol/L，高于Sham組的血尿素氮（4.2±0.8）mmol/L，血清肌酐（88±17）mmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為24.597和14.832，均Plt;0.05），IAKI動(dòng)物模型成立。

2.2 光鏡觀察結(jié)果 海馬結(jié)構(gòu)可分CA1、CA2、CA3和DG 4個(gè)亞區(qū)，由分子層、錐體細(xì)胞層和顆粒層組成。Sham組海馬結(jié)構(gòu)清晰，錐體細(xì)胞層無異常變化，見圖1A。IAKI組海馬明顯的變化發(fā)生在CA1區(qū)錐體細(xì)胞層，出現(xiàn)了固縮的神經(jīng)元，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均固縮，見圖1B、C。

2.3 電鏡觀察結(jié)果 Sham組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層神經(jīng)元呈正常結(jié)構(gòu)，見圖2A，細(xì)胞核圓形，染色質(zhì)疏松，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)電子密度中等，核糖體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰可見。IAKI組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層神經(jīng)元呈固縮狀，細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞核萎縮，核仁依然可見，染色質(zhì)無固縮邊聚表現(xiàn)，見圖2B；高倍鏡下可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹變性，脊紊亂，見圖2C（箭頭所示）。

Figure 2 The electron microscope image of hippocampal CA1 pyramidal neurons圖2 海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層神經(jīng)元電鏡圖像

2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 Sham組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層PARP-1呈陰性染色，見圖3A，IAKI組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層固縮的神經(jīng)元PARP-1呈陽性表達(dá)，陽性顆粒集中出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)，見圖3B，少許出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，見圖3C；2組caspase-3均呈陰性表達(dá)。

2.5 免疫印跡檢測(cè)分析結(jié)果 2組caspase-3表達(dá)均不明顯；IAKI組海馬PARP-1蛋白表達(dá)量高于sham組（0.579 6±0.103 5vs0.351 3±0.092 3，t=3.293，Plt;0.05），見圖4。

Figure 4 Results of immunoblot analysis of PARP-1 in two groups圖4 2組PARP-1免疫印跡電泳條帶

3 討論

國內(nèi)外常用的大鼠AKI動(dòng)物模型有缺血性和非缺血性2種，前者為腎缺血再灌注損傷引起的，多采用腎缺血60 min再灌注24 h[7]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出大鼠腎缺血60 min再灌注24 h后（IAKI組）腎功能嚴(yán)重?fù)p傷，說明本實(shí)驗(yàn)IAKI動(dòng)物模型是成立的。

有報(bào)道IAKI引起腎外器官某些細(xì)胞發(fā)生固縮性損傷，如肝細(xì)胞[7]。本課題組也有同樣的發(fā)現(xiàn)[8]，光鏡下細(xì)胞固縮，有的核染色質(zhì)固縮，有的則無固縮表現(xiàn)，經(jīng)電子顯微鏡觀察以及caspase-3免疫組化染色發(fā)現(xiàn)部分光鏡下所見的固縮性損傷為凋亡的肝細(xì)胞。IAKI誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的固縮性改變是否屬于細(xì)胞凋亡尚未知。Liu等[6]于2008年報(bào)道IAKI誘導(dǎo)海馬錐體細(xì)胞層發(fā)生固縮性損傷的形態(tài)學(xué)改變，并提出了固縮性神經(jīng)元（pyknotic neuron）這一概念，但只是在光鏡下所見，沒有進(jìn)行電子顯微鏡觀察以及PARP-1和caspase-3等免疫組化染色分析。從形態(tài)學(xué)角度確認(rèn)細(xì)胞死亡的條件有4個(gè)：（1）細(xì)胞膜完整性消失。（2）細(xì)胞核固縮碎片化。（3）被吞噬或自噬。（4）細(xì)胞固縮，主要細(xì)胞器空泡化，又稱細(xì)胞質(zhì)死亡（cytoplasmic death）[9]。本研究應(yīng)用電鏡觀察發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層固縮的神經(jīng)元細(xì)胞核染色質(zhì)無固縮邊聚的表現(xiàn)，細(xì)胞器的損傷也不支持凋亡的結(jié)論；同樣也沒有細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜破潰等細(xì)胞壞死的特征；也沒有被吞噬的表現(xiàn)；但具有細(xì)胞質(zhì)死亡的特點(diǎn)，光鏡下細(xì)胞固縮，電鏡下主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)主要細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等呈腫脹空泡化。

2012年國際細(xì)胞死亡分類命名委員會(huì)在倡議綜述中提出，從分子生物學(xué)或生物化學(xué)角度命名細(xì)胞死亡的時(shí)代已經(jīng)來臨。Caspase依賴的細(xì)胞死亡和PARP-1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是典型的2種不同形式的細(xì)胞死亡。Caspase-3是外源性凋亡的執(zhí)行者（excutor），也是判斷細(xì)胞凋亡的生化標(biāo)志（biochemi?cal marker）[2,10]，PARP-1的過度激活引起的細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡，也稱PARP-1介導(dǎo)的細(xì)胞損傷（PARP-1 mediated cell injury）或PARP-1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[3,11]。本實(shí)驗(yàn)免疫印跡檢測(cè)分析及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示缺血性急性腎損傷的海馬cas?pase-3陰性表達(dá)而PARP-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，說明IA?KI誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的固縮性改變不屬于caspase依賴的細(xì)胞死亡（細(xì)胞凋亡），可能是由于PARP-1的過度激活引起的細(xì)胞損傷或死亡。

Figure 3 The photos of PARP-1 immunohistochemical staining圖3 PARP-1免疫組織化學(xué)染色圖像（×200）

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