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        預(yù)注射供體凋亡細(xì)胞對移植胰島存活及外周血T淋巴細(xì)胞功能的影響*

        2014-12-03 03:51:12李雙喜李寶雷蔡德鴻
        天津醫(yī)藥 2014年2期

        李雙喜 柳 媛 李寶雷 楊 樹 陳 宏 蔡德鴻 張 振

        細(xì)胞凋亡是普遍發(fā)生于生物界的一種基本生命現(xiàn)象,它是指由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程。凋亡細(xì)胞在其細(xì)胞膜破裂、內(nèi)容物釋放到周圍組織之前即被吞噬細(xì)胞所清除,不引起機(jī)體的炎癥和免疫反應(yīng),即凋亡細(xì)胞的快速清除使得機(jī)體“被動”地避免了免疫反應(yīng),現(xiàn)有較多研究表明:凋亡對免疫系統(tǒng)存在著主動的調(diào)節(jié)作用,有研究者報道靜脈輸注供體凋亡細(xì)胞可促進(jìn)骨髓、肝臟、心臟及胰島細(xì)胞等移植的成功[1-2],但其具體機(jī)制至今仍未明確。本研究采用大鼠胰島移植前預(yù)先注射凋亡細(xì)胞的方法建立凋亡細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的研究模型,動態(tài)分析受體外周血T淋巴細(xì)胞的增殖活化能力,檢測不同T淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子干擾素(IFN)-γ、白介素(IL)-10及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1的分泌變化,探索凋亡細(xì)胞參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的可能機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料 清潔級雄性Wistar大鼠(供體)、SD大鼠(受體)各42只,購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(碧云天公司);膠原酶P、Ficoll-400、鏈脲佐菌素(STZ)、重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)購自美國Sigma公司;Ficoll-400(瑞典Amersham Biosciences公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT,美國GIBCO公司);FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司);Luminex 100 Integrated System 2.2(多功能流式點(diǎn)陣儀)、Luminex xMapTM Technology(美國Luminex公司);Bio-Rad Model 680自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞的制備 取Wistar大鼠,麻醉后摘取脾臟,通過不銹鋼篩網(wǎng)研磨獲取脾淋巴細(xì)胞懸液。直線加速器照射獲得凋亡細(xì)胞的方法(照射劑量2.0 Gy,照射后培養(yǎng)8 h),即可獲得較高凋亡率(gt;70%)的凋亡細(xì)胞。壞死淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備:取制備好的正常脾細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度約4×106/mL,56℃水浴箱震蕩搖勻1 h。

        1.2.2 SD大鼠糖尿病模型制備及分組 經(jīng)腹腔注射STZ(60 mg/kg),制備大鼠糖尿病模型(連續(xù)2次血糖>16.7 mmol/L)。造模成功后分別接受生理鹽水、正常脾淋巴細(xì)胞、凋亡脾淋巴細(xì)胞及壞死脾細(xì)胞注射處理。調(diào)整各種細(xì)胞濃度為1×108/mL,通過大鼠尾靜脈分別注射。將受體SD大鼠稱質(zhì)量,按照完全隨機(jī)分組法中隨機(jī)數(shù)字表法分為4組,其中凋亡細(xì)胞處理組12只,正常細(xì)胞處理組12只,生理鹽水處理組9只,壞死細(xì)胞處理組9只。

        1.2.3 胰島移植模型的構(gòu)建 采用膠原酶P進(jìn)行胰管灌注并消化,F(xiàn)icoll-400不連續(xù)梯度純化獲得供體胰島;受體接受注射處理后7 d行腎包囊下胰島移植術(shù)。在受體SD大鼠腎包囊下移植細(xì)胞濃度為2 000 IEQ/mL(IEQ:胰島相當(dāng)量)的胰島細(xì)胞懸液大約0.5 mL,即約1 000 IEQ的胰島細(xì)胞團(tuán)。

        1.2.4 移植物存活時間監(jiān)測 胰島移植后受體血糖開始下降并穩(wěn)定,以后每隔2 d測血糖1次,血糖若連續(xù)2次高于11.0 mmol/L,則認(rèn)為移植胰島功能失活。

        1.2.5 MTT法檢測外周血T淋巴細(xì)胞的增殖功能 分別在胰島移植前、移植后1周、移植后2周及發(fā)生排斥反應(yīng)后取3只大鼠采取外周血約10 mL,使用密度梯度離心法收獲外周血單個核細(xì)胞(PBMCs),PBS液洗滌3次,以RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)2 h后,更換培養(yǎng)瓶,以含10 IU/mL rhIL-2的1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)PBMCs 4周,所獲得的細(xì)胞絕大多數(shù)為T淋巴細(xì)胞[3]。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL接種于24孔培養(yǎng)板中加入終濃度為10 mg/L的刀豆蛋白A(Co?nA),于37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)72 h。在每孔中加入MTT工作液10 μL孵育5 h,吸去每孔的上清液 100 μL,再加入100 μL的DMSO,微量振蕩器振蕩30 min,490 nm酶標(biāo)儀上測量光密度值(OD值)。

        1.2.6 受體外周血不同T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的檢測 各實(shí)驗(yàn)組分別于胰島移植前、移植后1周、移植后2周及發(fā)生排斥反應(yīng)后取3只受鼠,采取外周血1 mL,靜置30 min,1 000×g離心3 min,抽取上清液(或者保存于-20℃環(huán)境,再次檢測前3 000×g離心5 min),將上清液以Serum Matrix為稀釋劑稀釋5倍,立即將樣本置入-80℃保存。Luminex 100 In?tegrated System開機(jī),準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及對照樣本液后進(jìn)行上樣測定IFN-γ、IL-10水平,利用酶聯(lián)免疫方法測定血清標(biāo)本中TGF-β1的水平。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±ss)表示;胰島存活時間采用Ka?plan-Meier方法進(jìn)行生存分析,組間比較采用Log-Rank檢驗(yàn);其他指標(biāo)多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn),2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對樣本t檢驗(yàn),Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同預(yù)處理因素對移植胰島存活的影響 生理鹽水處理組、正常細(xì)胞處理組、凋亡細(xì)胞處理組及壞死細(xì)胞處理組移植胰島中位生存時間分別為6、10、30、6 d,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=30.67,Plt;0.001),其中凋亡細(xì)胞處理組較生理鹽水處理組、正常細(xì)胞處理組及壞死細(xì)胞處理組移植胰島生存時間延長(χ2分別為12.02、11.84及11.61,均Plt;0.001),正常細(xì)胞處理組較生理鹽水處理組及壞死細(xì)胞處理組移植胰島生存時間延長(χ2分別為12.02、11.61,均Plt;0.001)。

        2.2 不同預(yù)處理因素對受體T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響 見圖1。凋亡細(xì)胞處理組外周血T淋巴細(xì)胞的增殖能力在移植前達(dá)到最低,與其他3組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=373.957,Plt;0.001);這種差異維持到移植后 1周(F=260.746,Plt;0.001)、2周(F=205.910,Plt;0.001),而在發(fā)生排斥反應(yīng)后消失(F=0.626,Pgt;0.05)。正常細(xì)胞處理外周血T淋巴細(xì)胞的增殖能力也有所被抑制,在移植前、移植后1周與生理鹽水處理組及壞死細(xì)胞處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均Plt;0.001),排斥反應(yīng)后差異消失(均Pgt;0.05)。

        Figure 1 The proliferative activity of T lymphocytes detected by MTT in different treatment groups圖1 MTT法測定各組T淋巴細(xì)胞的增殖能力

        2.3 不同處理因素對受體外周血T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的影響 凋亡細(xì)胞處理組IFN-γ水平在移植后1周、2周與移植前相比明顯升高(均Plt;0.05),而在排斥反應(yīng)后其水平繼續(xù)升高,與移植前、移植后1周及移植后2周相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均Plt;0.05)。各組之間移植前IFN-γ水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而在移植后1周、2周凋亡細(xì)胞處理組低于其他組(均Plt;0.05),見表1。凋亡細(xì)胞處理組IL-10及TGF-β1水平在排斥反應(yīng)后與移植前、移植后1周及移植后2周相比均明顯降低(均Plt;0.05);而各組之間IL-10及TGF-β1水平在移植前、移植1周及移植后2周差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,其中凋亡細(xì)胞處理組IL-10及TGF-β1水平在移植前、移植后1周及移植后2周均明顯高于其他組(均Plt;0.05),見表2、3。

        Table 1 Serum concentrations of IFN-γ of diabetic rats in different treatment groups表1 各處理組糖尿病大鼠外周血IFN-γ水平(ng/L,x±s)

        Table 2 Serum concentrations of IL-10 of diabetic rats in different treatment groups表2 各處理組糖尿病大鼠外周血IL-10水平(ng/L,x±s)

        Table 3 Serum concentrations of TGF-β1 of diabetic rats in different treatment groups表3 各處理組糖尿病大鼠外周血TGF-β1水平

        3 討論

        凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比具有低免疫原性的特點(diǎn),對機(jī)體主要免疫細(xì)胞具有主動的調(diào)節(jié)作用,壞死細(xì)胞活化樹突狀細(xì)胞(DC),而凋亡細(xì)胞則通過早期表達(dá)的膜聯(lián)蛋白及表面的toll樣受體抑制DC的活化,發(fā)揮免疫抑制作用,或被不成熟的DC吞噬后無法誘導(dǎo)細(xì)胞表面MHCⅡ分子、CD40、CD80等表達(dá)而影響T淋巴細(xì)胞的活化,甚至對脂多糖亦不產(chǎn)生反應(yīng)[4-6]。在脾細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系中加入凋亡細(xì)胞,可顯著抑制ConA刺激的T細(xì)胞增殖和活化,證實(shí)凋亡細(xì)胞在體外對T淋巴細(xì)胞活化有直接抑制作用[7]。在體外培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞中加入凋亡細(xì)胞,可以抑制細(xì)菌脂多糖刺激后的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1和IL-12,而促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生[8]。凋亡細(xì)胞另一方面也無法提供T淋巴細(xì)胞活化所需的共刺激分子,影響第二信號系統(tǒng),從而抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生[9]。本研究顯示:移植前凋亡細(xì)胞處理組與其他各組相比明顯抑制了受體外周血T淋巴細(xì)胞的增殖及活化能力;凋亡細(xì)胞可明顯減弱受體外周血IFN-γ分泌的增加趨勢,而明顯促進(jìn)IL-10、TGF-β1的分泌。

        凋亡細(xì)胞能夠誘導(dǎo)受體產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg,Tr),并能促使Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化,而后者則能使相應(yīng)T細(xì)胞失能,產(chǎn)生免疫耐受[10]。各類Tr通過分泌不同的細(xì)胞因子發(fā)揮作用,IFN-γ是主要的Th1型細(xì)胞因子,與移植排斥反應(yīng)關(guān)系密切,能促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞,并抑制Th2細(xì)胞增生,激活中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的功能和殺傷活性[11];同種異體心臟移植受體小鼠移植術(shù)后6 d血清及移植心臟IFN-γ表達(dá)明顯升高,這與移植物出現(xiàn)組織學(xué)改變的時間吻合,表明IFN-γ在排斥反應(yīng)中起重要作用[12]。IL-10主要由特定的T細(xì)胞亞群(Th2、Tr1)產(chǎn)生,CD4+CD25+Treg能分泌大劑量的IL-10[6]。IL-10是一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子,能抑制Th1細(xì)胞的增殖及IL-2、IL-3、IFN-γ、TNF以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等細(xì)胞因子合成,并抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ抗原和共刺激分子,阻斷單核巨噬細(xì)胞因子的產(chǎn)生,抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-12,抑制自然殺傷細(xì)胞的活性。早期凋亡細(xì)胞被DC吞噬后可以選擇性地減少促炎癥介質(zhì)的釋放,而選擇性地增加抑制免疫反應(yīng)介質(zhì)IL-10及TGF-β1的釋放[11]。大量動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明,移植免疫耐受發(fā)生時常伴有IL-10的高表達(dá),提示IL-10或Th2細(xì)胞因子可能參與移植免疫耐受的形成,并延長移植物的存活時間[13]。TGF-β1是TGF-β多種亞型中所占比例最高的一種,由Th3細(xì)胞分泌,是機(jī)體內(nèi)一種重要的免疫反應(yīng)負(fù)性調(diào)節(jié)因子,能拮抗多種淋巴細(xì)胞反應(yīng)[14]。凋亡細(xì)胞對免疫系統(tǒng)抑制時間的長短取決于其誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg的壽命,Treg主要通過P53誘導(dǎo)的CD28依賴的細(xì)胞凋亡的方式被清除,而TGF-β1可以促進(jìn)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Treg細(xì)胞并減少P53誘導(dǎo)的CD28依賴的細(xì)胞凋亡;將TGF-β1直接應(yīng)用或以基因轉(zhuǎn)移的方式用于心臟、胰島、肝臟及肺臟等組織器官的移植研究中,可誘導(dǎo)免疫耐受的產(chǎn)生[15]。

        總之,凋亡細(xì)胞對機(jī)體免疫系統(tǒng)存在重要的調(diào)控作用,對受體外周血T淋巴細(xì)胞增殖活化的抑制以及對不同T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞因子分泌的調(diào)控可能是其參與免疫調(diào)節(jié)及形成耐受的重要環(huán)節(jié),而其具體調(diào)控機(jī)制仍需更多深入研究。

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