李雙喜 柳 媛 李寶雷 楊 樹 陳 宏 蔡德鴻 張 振

細(xì)胞凋亡是普遍發(fā)生于生物界的一種基本生命現(xiàn)象，它是指由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程。凋亡細(xì)胞在其細(xì)胞膜破裂、內(nèi)容物釋放到周圍組織之前即被吞噬細(xì)胞所清除，不引起機(jī)體的炎癥和免疫反應(yīng)，即凋亡細(xì)胞的快速清除使得機(jī)體“被動”地避免了免疫反應(yīng)，現(xiàn)有較多研究表明：凋亡對免疫系統(tǒng)存在著主動的調(diào)節(jié)作用，有研究者報道靜脈輸注供體凋亡細(xì)胞可促進(jìn)骨髓、肝臟、心臟及胰島細(xì)胞等移植的成功[1-2]，但其具體機(jī)制至今仍未明確。本研究采用大鼠胰島移植前預(yù)先注射凋亡細(xì)胞的方法建立凋亡細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的研究模型，動態(tài)分析受體外周血T淋巴細(xì)胞的增殖活化能力，檢測不同T淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子干擾素（IFN）-γ、白介素（IL）-10及轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1的分泌變化，探索凋亡細(xì)胞參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性Wistar大鼠（供體）、SD大鼠（受體）各42只，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit（碧云天公司）；膠原酶P、Ficoll-400、鏈脲佐菌素（STZ）、重組人白細(xì)胞介素-2（rhIL-2）購自美國Sigma公司；Ficoll-400（瑞典Amersham Biosciences公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國GIBCO公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；Luminex 100 Integrated System 2.2（多功能流式點(diǎn)陣儀）、Luminex xMapTM Technology（美國Luminex公司）；Bio-Rad Model 680自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞的制備 取Wistar大鼠，麻醉后摘取脾臟，通過不銹鋼篩網(wǎng)研磨獲取脾淋巴細(xì)胞懸液。直線加速器照射獲得凋亡細(xì)胞的方法（照射劑量2.0 Gy，照射后培養(yǎng)8 h），即可獲得較高凋亡率（gt;70%）的凋亡細(xì)胞。壞死淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備：取制備好的正常脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度約4×106/mL，56℃水浴箱震蕩搖勻1 h。

1.2.2 SD大鼠糖尿病模型制備及分組 經(jīng)腹腔注射STZ（60 mg/kg），制備大鼠糖尿病模型（連續(xù)2次血糖＞16.7 mmol/L）。造模成功后分別接受生理鹽水、正常脾淋巴細(xì)胞、凋亡脾淋巴細(xì)胞及壞死脾細(xì)胞注射處理。調(diào)整各種細(xì)胞濃度為1×108/mL，通過大鼠尾靜脈分別注射。將受體SD大鼠稱質(zhì)量，按照完全隨機(jī)分組法中隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，其中凋亡細(xì)胞處理組12只，正常細(xì)胞處理組12只，生理鹽水處理組9只，壞死細(xì)胞處理組9只。

1.2.3 胰島移植模型的構(gòu)建 采用膠原酶P進(jìn)行胰管灌注并消化，F(xiàn)icoll-400不連續(xù)梯度純化獲得供體胰島；受體接受注射處理后7 d行腎包囊下胰島移植術(shù)。在受體SD大鼠腎包囊下移植細(xì)胞濃度為2 000 IEQ/mL（IEQ：胰島相當(dāng)量）的胰島細(xì)胞懸液大約0.5 mL，即約1 000 IEQ的胰島細(xì)胞團(tuán)。

1.2.4 移植物存活時間監(jiān)測 胰島移植后受體血糖開始下降并穩(wěn)定，以后每隔2 d測血糖1次，血糖若連續(xù)2次高于11.0 mmol/L，則認(rèn)為移植胰島功能失活。

1.2.5 MTT法檢測外周血T淋巴細(xì)胞的增殖功能 分別在胰島移植前、移植后1周、移植后2周及發(fā)生排斥反應(yīng)后取3只大鼠采取外周血約10 mL，使用密度梯度離心法收獲外周血單個核細(xì)胞（PBMCs），PBS液洗滌3次，以RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)2 h后，更換培養(yǎng)瓶，以含10 IU/mL rhIL-2的1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)PBMCs 4周，所獲得的細(xì)胞絕大多數(shù)為T淋巴細(xì)胞[3]。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL接種于24孔培養(yǎng)板中加入終濃度為10 mg/L的刀豆蛋白A（Co?nA），于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)72 h。在每孔中加入MTT工作液10 μL孵育5 h，吸去每孔的上清液 100 μL，再加入100 μL的DMSO，微量振蕩器振蕩30 min，490 nm酶標(biāo)儀上測量光密度值(OD值)。

1.2.6 受體外周血不同T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的檢測 各實(shí)驗(yàn)組分別于胰島移植前、移植后1周、移植后2周及發(fā)生排斥反應(yīng)后取3只受鼠，采取外周血1 mL，靜置30 min，1 000×g離心3 min，抽取上清液（或者保存于-20℃環(huán)境，再次檢測前3 000×g離心5 min），將上清液以Serum Matrix為稀釋劑稀釋5倍，立即將樣本置入-80℃保存。Luminex 100 In?tegrated System開機(jī)，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及對照樣本液后進(jìn)行上樣測定IFN-γ、IL-10水平，利用酶聯(lián)免疫方法測定血清標(biāo)本中TGF-β1的水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±ss）表示；胰島存活時間采用Ka?plan-Meier方法進(jìn)行生存分析，組間比較采用Log-Rank檢驗(yàn)；其他指標(biāo)多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對樣本t檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同預(yù)處理因素對移植胰島存活的影響 生理鹽水處理組、正常細(xì)胞處理組、凋亡細(xì)胞處理組及壞死細(xì)胞處理組移植胰島中位生存時間分別為6、10、30、6 d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=30.67，Plt;0.001），其中凋亡細(xì)胞處理組較生理鹽水處理組、正常細(xì)胞處理組及壞死細(xì)胞處理組移植胰島生存時間延長（χ2分別為12.02、11.84及11.61，均Plt;0.001），正常細(xì)胞處理組較生理鹽水處理組及壞死細(xì)胞處理組移植胰島生存時間延長（χ2分別為12.02、11.61，均Plt;0.001）。

2.2 不同預(yù)處理因素對受體T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響 見圖1。凋亡細(xì)胞處理組外周血T淋巴細(xì)胞的增殖能力在移植前達(dá)到最低，與其他3組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=373.957，Plt;0.001）；這種差異維持到移植后 1周（F=260.746，Plt;0.001）、2周（F=205.910，Plt;0.001），而在發(fā)生排斥反應(yīng)后消失（F=0.626，Pgt;0.05）。正常細(xì)胞處理外周血T淋巴細(xì)胞的增殖能力也有所被抑制，在移植前、移植后1周與生理鹽水處理組及壞死細(xì)胞處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.001），排斥反應(yīng)后差異消失（均Pgt;0.05）。

Figure 1 The proliferative activity of T lymphocytes detected by MTT in different treatment groups圖1 MTT法測定各組T淋巴細(xì)胞的增殖能力

2.3 不同處理因素對受體外周血T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的影響 凋亡細(xì)胞處理組IFN-γ水平在移植后1周、2周與移植前相比明顯升高（均Plt;0.05），而在排斥反應(yīng)后其水平繼續(xù)升高，與移植前、移植后1周及移植后2周相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05）。各組之間移植前IFN-γ水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而在移植后1周、2周凋亡細(xì)胞處理組低于其他組（均Plt;0.05），見表1。凋亡細(xì)胞處理組IL-10及TGF-β1水平在排斥反應(yīng)后與移植前、移植后1周及移植后2周相比均明顯降低（均Plt;0.05）；而各組之間IL-10及TGF-β1水平在移植前、移植1周及移植后2周差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中凋亡細(xì)胞處理組IL-10及TGF-β1水平在移植前、移植后1周及移植后2周均明顯高于其他組（均Plt;0.05），見表2、3。

Table 1 Serum concentrations of IFN-γ of diabetic rats in different treatment groups表1 各處理組糖尿病大鼠外周血IFN-γ水平（ng/L，x±s）

Table 2 Serum concentrations of IL-10 of diabetic rats in different treatment groups表2 各處理組糖尿病大鼠外周血IL-10水平（ng/L，x±s）

Table 3 Serum concentrations of TGF-β1 of diabetic rats in different treatment groups表3 各處理組糖尿病大鼠外周血TGF-β1水平

3 討論

凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比具有低免疫原性的特點(diǎn)，對機(jī)體主要免疫細(xì)胞具有主動的調(diào)節(jié)作用，壞死細(xì)胞活化樹突狀細(xì)胞（DC），而凋亡細(xì)胞則通過早期表達(dá)的膜聯(lián)蛋白及表面的toll樣受體抑制DC的活化，發(fā)揮免疫抑制作用，或被不成熟的DC吞噬后無法誘導(dǎo)細(xì)胞表面MHCⅡ分子、CD40、CD80等表達(dá)而影響T淋巴細(xì)胞的活化，甚至對脂多糖亦不產(chǎn)生反應(yīng)[4-6]。在脾細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系中加入凋亡細(xì)胞，可顯著抑制ConA刺激的T細(xì)胞增殖和活化，證實(shí)凋亡細(xì)胞在體外對T淋巴細(xì)胞活化有直接抑制作用[7]。在體外培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞中加入凋亡細(xì)胞，可以抑制細(xì)菌脂多糖刺激后的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1和IL-12，而促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生[8]。凋亡細(xì)胞另一方面也無法提供T淋巴細(xì)胞活化所需的共刺激分子，影響第二信號系統(tǒng)，從而抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生[9]。本研究顯示：移植前凋亡細(xì)胞處理組與其他各組相比明顯抑制了受體外周血T淋巴細(xì)胞的增殖及活化能力；凋亡細(xì)胞可明顯減弱受體外周血IFN-γ分泌的增加趨勢，而明顯促進(jìn)IL-10、TGF-β1的分泌。

凋亡細(xì)胞能夠誘導(dǎo)受體產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg,Tr），并能促使Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而后者則能使相應(yīng)T細(xì)胞失能，產(chǎn)生免疫耐受[10]。各類Tr通過分泌不同的細(xì)胞因子發(fā)揮作用，IFN-γ是主要的Th1型細(xì)胞因子，與移植排斥反應(yīng)關(guān)系密切，能促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，并抑制Th2細(xì)胞增生，激活中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的功能和殺傷活性[11]；同種異體心臟移植受體小鼠移植術(shù)后6 d血清及移植心臟IFN-γ表達(dá)明顯升高，這與移植物出現(xiàn)組織學(xué)改變的時間吻合，表明IFN-γ在排斥反應(yīng)中起重要作用[12]。IL-10主要由特定的T細(xì)胞亞群（Th2、Tr1）產(chǎn)生，CD4+CD25+Treg能分泌大劑量的IL-10[6]。IL-10是一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，能抑制Th1細(xì)胞的增殖及IL-2、IL-3、IFN-γ、TNF以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等細(xì)胞因子合成，并抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ抗原和共刺激分子，阻斷單核巨噬細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-12，抑制自然殺傷細(xì)胞的活性。早期凋亡細(xì)胞被DC吞噬后可以選擇性地減少促炎癥介質(zhì)的釋放，而選擇性地增加抑制免疫反應(yīng)介質(zhì)IL-10及TGF-β1的釋放[11]。大量動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，移植免疫耐受發(fā)生時常伴有IL-10的高表達(dá)，提示IL-10或Th2細(xì)胞因子可能參與移植免疫耐受的形成，并延長移植物的存活時間[13]。TGF-β1是TGF-β多種亞型中所占比例最高的一種，由Th3細(xì)胞分泌，是機(jī)體內(nèi)一種重要的免疫反應(yīng)負(fù)性調(diào)節(jié)因子，能拮抗多種淋巴細(xì)胞反應(yīng)[14]。凋亡細(xì)胞對免疫系統(tǒng)抑制時間的長短取決于其誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg的壽命，Treg主要通過P53誘導(dǎo)的CD28依賴的細(xì)胞凋亡的方式被清除，而TGF-β1可以促進(jìn)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Treg細(xì)胞并減少P53誘導(dǎo)的CD28依賴的細(xì)胞凋亡；將TGF-β1直接應(yīng)用或以基因轉(zhuǎn)移的方式用于心臟、胰島、肝臟及肺臟等組織器官的移植研究中，可誘導(dǎo)免疫耐受的產(chǎn)生[15]。

總之，凋亡細(xì)胞對機(jī)體免疫系統(tǒng)存在重要的調(diào)控作用，對受體外周血T淋巴細(xì)胞增殖活化的抑制以及對不同T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞因子分泌的調(diào)控可能是其參與免疫調(diào)節(jié)及形成耐受的重要環(huán)節(jié)，而其具體調(diào)控機(jī)制仍需更多深入研究。

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