戰(zhàn)京燕 陳懷永 吳 琦△ 孫 昕 馮 靖 李 雪 徐 龍 包翠萍

呼吸重疊綜合征是阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA） 和慢性阻塞性肺疾?。–OPD）共存的疾病[1]，間歇低氧(IH)和肺氣腫是其主要的病理學(xué)基礎(chǔ)[2-3]。流行病學(xué)研究顯示成年男性中呼吸重疊綜合征的患病率近1%，其并發(fā)癥和死亡率均較高[1]。這些研究表明呼吸重疊綜合征并非OSA和COPD的簡(jiǎn)單疊加，但是可以確定的是患者的低氧狀態(tài)進(jìn)一步加重[4]。低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是維持低氧環(huán)境下的氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，HIF-1α介導(dǎo)一系列適應(yīng)性反應(yīng)，同時(shí)也可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[5]。有研究表明在OSA[6]和COPD[7]肝組織中，HIF-1α表達(dá)水平上調(diào)，但在呼吸重疊綜合征中，肝組織HIF-1α的表達(dá)如何變化有待進(jìn)一步研究。本研究通過模擬呼吸重疊綜合征模式下的IH合并肺氣腫大鼠模型，探討IH合并肺氣腫對(duì)大鼠肝臟HIF-1α、凋亡調(diào)控基因的影響，及HIF-1α與凋亡調(diào)控基因的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步探討通過藥理途徑抑制HIF-1α參與細(xì)胞凋亡奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性6周齡SPF級(jí)Wistar大鼠60只，體質(zhì)量（180±20）g，許可證號(hào)：SCXK 津2010-0002。氣體氧濃度監(jiān)測(cè)器（瑞士夏美頓公司產(chǎn)品），流量流速表（余姚工業(yè)自動(dòng)化儀表廠），血?dú)夥治鰞x（瑞士羅氏AVL 995），熏箱為玻璃箱改制，低氧艙為大號(hào)密封盒改制；梯度PCR儀(Bio-Rad公司)，熒光實(shí)時(shí)定量（qRT）PCR儀(Lightcycle Roche公司)，RNA濃度測(cè)定儀（環(huán)亞生物科技有限公司）。大前門烤煙型香煙（焦油含量23 mg/支，尼古丁含量約1 mg/支，天津卷煙廠生產(chǎn)）；Trizol購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TIAN GEN生物技術(shù)公司，SYBR?Green購自Bio-Rad公司。低氧暴露裝置[8]按照編寫程序控制間歇低氧/正常氧循環(huán)次數(shù)及循環(huán)時(shí)間，按單片機(jī)芯片所預(yù)定程序，間接控制電磁閥通斷，繼而控制壓縮空氣或純氮通斷。自行設(shè)計(jì)密封盒低氧艙，兩端設(shè)有氣流進(jìn)出開口，氣體流速儀器調(diào)定進(jìn)入低氧艙中氣體流速大小，氧濃度測(cè)定儀測(cè)定艙內(nèi)氧濃度變化。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為4組，每組15只。正常對(duì)照組：正常飼養(yǎng)；IH組：從第1周起在睡眠時(shí)段（9:00—17:00）將大鼠置于自制間歇低氧艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)夂涂諝?，每一循環(huán)120 s，即30 s充入氮?dú)猓?0 L/min），90 s充入空氣（15 L/min 50 s，5 L/min 40 s），1 h睡眠時(shí)間共進(jìn)行30次循環(huán)[8]；肺氣腫組：從第1周起每天8:00和18:00（非睡眠時(shí)段）2次于自制熏箱內(nèi)熏吸香煙共約1 h（每次約30 min）[9]；IH合并肺氣腫組：從第1周起熏煙暴露（方法同肺氣腫組）同時(shí)在睡眠時(shí)段（9:00—17:00）進(jìn)行低氧氣體循環(huán)暴露（方法同IH組）。所有處理均持續(xù)14周。

1.2.2 血?dú)夥治?于第9周初，每組隨機(jī)抽取5只大鼠固定后頭及胸部暴露于自制間歇低氧艙內(nèi)，用利多卡因表面麻醉后開腹，暴露腹主動(dòng)脈，于通入氮?dú)夂?0 s時(shí)及通入壓縮空氣50 s時(shí)，取4組的腹主動(dòng)脈血檢測(cè)動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)。測(cè)量結(jié)束后處死大鼠。

1.2.3 肺組織的留取 將剩余的每組10只大鼠麻醉后仰臥固定在操作臺(tái)上，開胸后暴露氣管并結(jié)扎右主支氣管，迅速取右肺下葉中段的少血組織放入10%福爾馬林固定液中固定2 h。石蠟包埋連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。取相同部位右肝組織（0.5 cm×0.5 cm），置于-80℃保存。

1.2.4 HIF-1α、Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)測(cè)定 于肝組織中加入1 mL Trizol，勻漿器勻漿3 min左右；加入200 μL氯仿室溫靜置3 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；吸取上層水相，加入同體積異丙醇，混勻，-80℃靜置25 min后，12 000 r/min，4℃離心10 min；棄上清，加入1 mL冰乙醇（75%無水乙醇，25%DEPC處理水，冰上配制），8 000 r/min，4℃離心5 min；棄上清，65 ℃烤箱烤5 min，加入 30 μL RNase-Free ddH2O，55 ℃烤箱助熔10 min；取2 μL測(cè)濃度及純度；取總RNA 3 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后以qRT-PCR儀測(cè)定肝組織中HIF-1α mRNA 、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA。PCR總反應(yīng)體系10 μL，循環(huán)參數(shù)：50℃ 2 min，95℃預(yù)變性3 min，然后95℃10 s，60℃30 s，72℃20 s，40個(gè)循環(huán)。PCR引物由華大基因合成，序列見表1。管家基因GAPDH標(biāo)化樣品，結(jié)果數(shù)值以Ct值來表示，重復(fù)檢測(cè)3次取平均值。計(jì)算待測(cè)樣品△Ct=待測(cè)樣品目的基因Ct值－待測(cè)樣品GAPDH Ct值。待測(cè)樣品目的基因相對(duì)表達(dá)量為2-△Ct。

Table 1 Primer sequences of HIF-1α,Bax,Bcl-2 and GAPDH表1HIF-1α、Bax、Bcl-2及GAPDH引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，定量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni法，相關(guān)性分析采用Pearson法，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

光鏡下肺氣腫組及IH合并肺氣腫組的肺組織切片HE染色均呈現(xiàn)明顯肺氣腫樣改變；血?dú)獗O(jiān)測(cè)結(jié)果顯示單純IH組：血氧飽和度（SaO2）最低為0.864±0.018，動(dòng)脈血氧分壓[p（O2）]為（50.00±2.74）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；肺氣腫合并IH組：SaO2最低為0.834±0.027，p（O2）為（47.80±3.56）mmHg，且上述2組的SaO2和p（O2）均周期性降低并恢復(fù)至正常水平。證實(shí)IH合并肺氣腫大鼠模型建立成功。

Figure 1 Comparison of expressions of HIF-1α mRNA(A),Bax mRNA(B),Bcl-2 mRNA(C)and Bax/Bcl-2(D)between four groups圖1 4組大鼠肝組織HIF-1α mRNA（A）、Bax mRNA（B）、Bcl-2 mRNA（C）及Bax/Bcl-2（D）比較

2.1 4組大鼠肝臟HIF-1α mRNA、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA及Bax/Bcl-2的表達(dá)水平比較 見圖1。與正常對(duì)照組相比，IH組的HIF-1α mRNA、Bax mRNA及Bax/Bcl-2水平均上調(diào)，Bcl-2 mRNA水平下調(diào)（均Plt;0.05）；與正常對(duì)照組相比，肺氣腫組的HIF-1α mRNA水平上調(diào)，Bcl-2 mRNA水平下調(diào)（Plt;0.05），Bax mRNA及Bax/Bcl-2水平無明顯變化（均Pgt;0.05）。與肺氣腫組和IH組相比，IH合并肺氣腫組的HIF-1α mRNA、Bax mRNA及Bax/Bcl-2水平均上調(diào)（均Plt;0.05）；與肺氣腫組相比，IH合并肺氣腫組的Bcl-2 mRNA水平下調(diào)（Plt;0.05）；與IH組相比，IH合并肺氣腫組的Bcl-2 mRNA水平無顯著變化（Pgt;0.05）。

2.2 肝組織HIF-1α mRNA與Bax mRNA、Bcl-2 mRNA及Bax/Bcl-2的相關(guān)性分析 HIF-1α mRNA與Bax mRNA、Bax/Bcl-2水平呈正相關(guān)（r分別為0.732和0.699，均Plt;0.001），HIF-1α mRNA與Bcl-2 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.705,Plt;0.001）。

3 討論

呼吸重疊綜合征為COPD和OSA并存的疾病[1]，IH和肺氣腫及由肺氣腫引起的持續(xù)低氧（SH）是呼吸重疊綜合征的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[2-3]，故與單純的COPD和OSA相比，呼吸重疊綜合征患者的夜間氧飽和度明顯下降（IH并SH）[4]，其全身炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)也有顯著的增加[1]。這些研究均表明呼吸重疊綜合征并不是OSA和COPD的簡(jiǎn)單疊加，IH、肺氣腫及SH可協(xié)同致病。HIF-1α是維持低氧環(huán)境下的氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，常氧環(huán)境下濃度很低，低氧環(huán)境下與其他組織比較，肝組織HIF-1α表達(dá)明顯上調(diào)[6]。HIF-1α介導(dǎo)一系列適應(yīng)性反應(yīng)的同時(shí)也誘導(dǎo)了很多病理性反應(yīng)，如細(xì)胞的凋亡[5]。本組研究顯示IH和肺氣腫處理均可導(dǎo)致HIF-1α mRNA水平上調(diào)。且IH合并肺氣腫處理后大鼠肝組織的HIF-1α mRNA水平較單純IH及肺氣腫處理顯著上調(diào)，說明IH和肺氣腫在誘導(dǎo)HIF-1α水平上調(diào)方面起協(xié)同作用，較單純的OSA、COPD而言，呼吸重疊綜合征對(duì)HIF-1α水平的影響更大。相比單純的OSA和COPD患者，呼吸重疊綜合征患者的嚴(yán)重低氧狀態(tài)以及低氧-再氧和產(chǎn)生的大量活性氧簇（ROS）直接協(xié)同導(dǎo)致了HIF-1α水平的上調(diào)，并且呼吸重疊綜合征患者嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的細(xì)胞因子（如NF-κB）的增加也間接導(dǎo)致了HIF-1α水平上調(diào)。

HIF-1α參與并促進(jìn)了肝細(xì)胞的凋亡[5]。OSA可通過觸發(fā)肝細(xì)胞凋亡而引起肝損傷[6]，Savransky等[10]對(duì)慢性IH引起的肝臟損害動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞的凋亡，這些研究均表明肝細(xì)胞的凋亡在肝損傷中發(fā)揮著重要的作用。Bax、Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡的管家基因[11]。本研究表明，IH暴露后Bax mRNA水平及Bax/Bcl-2較正常對(duì)照組均上調(diào)，Bcl-2 mRNA水平較正常對(duì)照組下調(diào)，提示IH對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控基因產(chǎn)生了影響。同時(shí)本研究顯示肺氣腫組合并IH暴露后凋亡調(diào)控基因Bax mRNA水平及Bax/Bcl-2的比例較單純IH和肺氣腫暴露均上調(diào)，說明較單純的OSA和COPD，呼吸重疊綜合征狀態(tài)對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控基因表達(dá)的影響更大，可引起更為嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡，或可預(yù)示呼吸重疊綜合征狀態(tài)對(duì)肝組織的損害更大。

本研究結(jié)果顯示HIF-1α mRNA與Bax mRNA、Bax/Bcl-2水平呈正相關(guān)，與Bcl-2 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，提示 HIF-1α mRNA 與 Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)相關(guān)。Carmeliet等[12]研究中發(fā)現(xiàn)HIF-1α參與了細(xì)胞凋亡，并與Bcl-2的表達(dá)相關(guān)，與本研究結(jié)果相符。HIF-1α可通過識(shí)別序列5＇-(A/G)CGTG-3＇與靶基因的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[13]。本研究結(jié)果提示HIF-1α可能通過調(diào)控靶基因Bax、Bcl-2的轉(zhuǎn)錄過程從而參與細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起肝損傷。

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