徐宏艷 張玉民 楊翠紅 劉金劍 褚麗萍 閆玉軍 劉鑒峰 宋娜玲

自組裝多肽納米纖維因其良好的生物相容性、合成簡(jiǎn)單、易于設(shè)計(jì)及修飾等優(yōu)點(diǎn)受到生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域?qū)W者的廣泛關(guān)注，已被用做三維細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)[1-2]、組織工程[3-4]以及藥物的緩控釋載體[5-6]等。早期研究的自組裝多肽納米材料主要是由天然氨基酸即L構(gòu)型氨基酸組成，但天然氨基酸組成的多肽在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)存在降解速率過(guò)快、穩(wěn)定性差的問(wèn)題，最近幾年已有學(xué)者將可以抵抗體內(nèi)蛋白酶降解的D構(gòu)型自組裝多肽應(yīng)用到體內(nèi)研究中[7-8]。氨基酸構(gòu)型的不同很可能對(duì)其體內(nèi)分布代謝產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響到其體內(nèi)的應(yīng)用。由于體內(nèi)大量蛋白和多肽的干擾，外源多肽在體內(nèi)難以通過(guò)常規(guī)手段檢測(cè)其含量，因此目前尚鮮見(jiàn)不同構(gòu)型氨基酸組成的多肽自組裝納米纖維在體內(nèi)分布代謝差異的報(bào)道。放射性核素標(biāo)記技術(shù)可將放射性核素標(biāo)記到外源多肽上，通過(guò)檢測(cè)放射性信號(hào)即可確定外源多肽在體內(nèi)的分布及含量，從而排除體內(nèi)蛋白等的干擾[9]。本研究利用125I對(duì)不同構(gòu)型氨基酸組成的多肽進(jìn)行標(biāo)記，自組裝成納米纖維后注射入小鼠體內(nèi)，系統(tǒng)地研究氨基酸不同構(gòu)型對(duì)其自組裝形成的納米纖維體內(nèi)分布的影響，為不同構(gòu)型氨基酸組成的多肽在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂和芴甲氧羰基（Fmoc）-氨基酸（吉爾生化上海有限公司）；哌啶、N,N′-二甲基甲酰胺、N,N-二異丙基乙胺、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯、三氟乙酸、二氯甲烷、乙醚等試劑（天津凱通化學(xué)試劑有限公司）；電鏡銅網(wǎng)、醋酸雙氧鈾（北京中鏡科儀技術(shù)有限公司）；Na125I（放射性比活度為12.95 GBq/mL，無(wú)載體，美國(guó)PE公司）；氯胺-T，偏重亞硫酸鈉（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）；BALB/c小鼠，雌性，體質(zhì)量（20±2）g（北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）。

1.1.2 主要儀器 小動(dòng)物活體成像儀（IS in vivo FX，美國(guó)KODAK公司）；全自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀（2470 WIZARD2，美國(guó)Perki?nElmer公司）；放射性薄層掃描儀（AR2000，美國(guó)BioScan公司）；1H核磁共振（VARIAN Unity Plus 400 MHZ，美國(guó)Varian Instruments公司)；質(zhì)譜儀（Finnigan LCQ AD，美國(guó)Thermo公司）；透射電子顯微鏡（Tecnai G2 F20系統(tǒng)，美國(guó)FEI公司)；高效液相色譜（HPLC，北京綠綿科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多肽合成及表征 利用2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂通過(guò)固相多肽合成方法制備N(xiāo)ap-GFFYGRGD和Nap-GDFDFDYGRGD（F和Y為D構(gòu)型氨基酸）。制備過(guò)程如下：首先將樹(shù)脂加到固相合成器中，在無(wú)水二氯甲烷中充分溶脹。然后將第一個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸（D）用無(wú)水二氯甲烷溶解，加入偶聯(lián)劑N,N-二異丙基乙基胺，轉(zhuǎn)移到上述固相合成器中，在室溫下反應(yīng)1 h。向固相合成器中加入封閉液（無(wú)水二氯甲烷∶N,N-二異丙基乙基胺∶無(wú)水甲醇體積比為17∶1∶2），室溫反應(yīng)10 min，然后加入含哌啶體積百分比為20%的N,N－二甲基甲酰胺溶液脫第一個(gè)氨基酸的Fmoc保護(hù)基團(tuán)。將需要加入的第二個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸（G）用N,N－二甲基甲酰胺溶解，加入羧基活化劑苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯和偶聯(lián)劑N,N-二異丙基乙基胺，轉(zhuǎn)移至固相合成器中室溫反應(yīng)2～3 h。按照上述方法依次加入需要反應(yīng)的氨基酸。最后一個(gè)氨基酸反應(yīng)完畢后，加入三氟乙酸與無(wú)水二氯甲烷（體積比為1∶99）混合液反應(yīng)10 min，將多肽鏈從樹(shù)脂上切下。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加入2次甲苯以除去殘留的三氟乙酸，用油泵抽干后得到粗品。用高效液相色譜進(jìn)行分離提純，通過(guò)核磁共振和高分辨率質(zhì)譜對(duì)多肽進(jìn)行表征。

1.2.2 多肽自組裝與形貌觀察 用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L PBS，pH 7.4）制備濃度為3 g/L的L-肽和D-肽溶液，于玻璃試管中加熱至沸騰，自然冷卻至室溫即得到自組裝的L-纖維和D-纖維溶液。分別取以上2種多肽纖維溶液10 μL至銅網(wǎng)上，用醋酸雙氧鈾染液染色5 s即制得透射電鏡樣品。將樣品放置干燥器內(nèi)過(guò)夜干燥，用于透射電鏡觀察樣品微觀形貌。

1.2.3 多肽125I標(biāo)記、純化及鑒定 多肽的125I標(biāo)記采用氯胺-T法。將100 μg多肽粉末用50 μL PBS完全溶解后加入0.5 mCi Na125I和50 μL氯胺-T溶液（1 g/L），室溫震蕩反應(yīng)5 min，再加入50 μL偏重亞硫酸鈉溶液（0.2 g/L）終止反應(yīng)。取1 μL反應(yīng)液點(diǎn)至硅膠板上，以V乙醇∶V水=9∶1為展開(kāi)劑，采用放射性薄層掃描儀對(duì)薄層板進(jìn)行掃描，計(jì)算標(biāo)記率。剩余反應(yīng)液通過(guò)放射性HPLC進(jìn)行純化。分別取2 μL純化后的溶液進(jìn)行薄板層析及薄層掃描，測(cè)定標(biāo)記化合物的放化純度。

1.2.4125I-多肽體外穩(wěn)定性檢測(cè) 分別取50 μL純化后的125I-Nap-GFFYGRGD和125I-Nap-GDFDFDYGRGD溶液，加入到200 μL人新鮮血清中，37℃培養(yǎng)箱中孵育72 h，分別在12、24、48和72 h取樣并采用1.2.3中的方法測(cè)定其放化純度。

1.2.5 組織分布 采用抽簽的方式將BALB/c小鼠隨機(jī)分為125I-Nap-GFFYGRGD和125I-Nap-GDFDFDYGRGD組，每組12只，分4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只。將125I標(biāo)記的2種多肽納米纖維溶液按1.85×104Bq/g劑量經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，分別在注射后1、3、6和12 h進(jìn)行眼球取血，脫頸處死后分別取心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、肌肉和腦，稱質(zhì)量并利用γ計(jì)數(shù)儀檢測(cè)各組織中的放射性活度，計(jì)算放射性攝取率，以每克組織放射性占注射量的百分比（%ID/g）表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用±ss表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多肽分子結(jié)構(gòu)及納米纖維形貌 多肽分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。透射電鏡結(jié)果顯示2種多肽均可自組裝成納米纖維，纖維直徑約為10～20 nm，纖維長(zhǎng)度為微米級(jí)，且L-纖維和D-纖維的微觀結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯差異，見(jiàn)圖2。

Figure 1 The molecular structures of Nap-GFFYGRGD and Nap-GDFDFDYGRGD圖1 多肽Nap-GFFYGRGD和Nap-GDFDFDYGRGD的分子結(jié)構(gòu)式

Figure 2 TEM images of peptide nanofibers圖2 多肽自組裝納米纖維的透射電鏡圖

2.2 多肽125I標(biāo)記及穩(wěn)定性 因多肽序列中含有酪氨酸殘基，因此可以將125I連接到酪氨酸的羥基苯環(huán)的鄰位上對(duì)多肽進(jìn)行標(biāo)記。結(jié)果顯示2種多肽均具有較高的標(biāo)記率，標(biāo)記率均在80%以上，見(jiàn)圖3。對(duì)標(biāo)記多肽進(jìn)行純化后的放化純度均在98%以上，可以滿足體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的要求。通過(guò)體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)可以初步判斷125I標(biāo)記的多肽在體內(nèi)是否容易出現(xiàn)125I脫離的現(xiàn)象。結(jié)果顯示標(biāo)記化合物在體外具有良好的穩(wěn)定性，72 h的血漿穩(wěn)定性在90%以上，見(jiàn)圖4。微量的125I脫離不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)明顯影響。

Figure 3 The TLC images of iodine-125 labeled peptides圖3 125I標(biāo)記多肽純化前后放射性薄層掃描圖

Figure 4 The result of in vitro stability of125I-Nap-GFFYGRGD圖4 125I-Nap-GFFYGRGD體外穩(wěn)定性結(jié)果

2.3 組織分布比較 結(jié)果顯示2種納米纖維在血液中第1、3和6 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在注射后1 h D-纖維的血液濃度高于L-纖維，之后較迅速地從血液中清除，3 h、6 h的血液濃度顯著低于L-纖維；而L-纖維在注射后6 h內(nèi)的血液濃度基本保持穩(wěn)定，但至12 h時(shí)較快衰減，兩種纖維血液濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，見(jiàn)表1。L-纖維和D-纖維在組織中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。L-纖維在胃中大量聚集，各個(gè)組織中的放射性含量在前6 h的變化較小，而D-纖維則在肝中大量分布，其次是腎和大腸，各組織中放射性含量隨時(shí)間變化明顯，較迅速地消除，見(jiàn)表2。

Table 1 The blood concentration of peptide nanofibers表1 多肽納米纖維不同時(shí)間的血藥濃度（%ID/g，x±s）

3 討論

3.1 多肽納米纖維在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 多肽納米纖維是一類新的生物醫(yī)用材料，其疏水端通過(guò)疏水相互作用力聚集在一起，而親水端伸展在水相中形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，通過(guò)環(huán)形結(jié)構(gòu)的不斷延伸組裝成長(zhǎng)的纖維。不同濃度的多肽納米纖維有不同的功能：高濃度納米纖維可以形成水凝膠，用于三維細(xì)胞培養(yǎng)、再生醫(yī)學(xué)中的組織填充物；而低濃度的納米纖維可以形成溶液，用作疏水性藥物的載體來(lái)提高藥物溶解度、靶向輸送藥物等。多肽納米纖維作為藥物載體的研究主要集中在抗腫瘤藥物載體的應(yīng)用方面。美國(guó)西北大學(xué)的Stupp等[10]將兩親性多肽分子（peptide amphliphile，PA）自組裝形成的多肽納米纖維包載疏水性抗癌藥物喜樹(shù)堿，通過(guò)靜脈注射治療荷瘤小鼠，結(jié)果顯示其顯著抑制了小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。加拿大滑鐵盧大學(xué)的Chen等[11]將由聚乙二醇（PEG）修飾的多肽分子AAP8-DEG形成的納米纖維通過(guò)疏水作用包載抗癌藥物玫瑰樹(shù)堿，通過(guò)增加玫瑰樹(shù)堿在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性提高了藥效。以上研究結(jié)果表明多肽納米纖維是一類潛在的臨床抗腫瘤藥物輸送載體。

Table 2 The distribution of nanofibers in different organs表2 多肽納米纖維的組織分布 （n=3，%ID/g，x±s）

3.2 D構(gòu)型氨基酸用于提高多肽納米材料的體內(nèi)穩(wěn)定性 由于體內(nèi)存在大量的蛋白酶，可以識(shí)別并降解由天然的L構(gòu)型氨基酸所組成的多肽和蛋白，因此會(huì)造成由L構(gòu)型氨基酸所組成的納米材料在體內(nèi)過(guò)早地崩解，從而造成所包裹藥物的過(guò)早釋放。為解決多肽在體內(nèi)被酶降解的問(wèn)題，已有研究者將非天然的D構(gòu)型氨基酸引入到多肽序列中，用于體內(nèi)研究并取得了一定的成果[12-13]。但目前對(duì)D構(gòu)型氨基酸組成的自組裝多肽納米纖維在體內(nèi)的分布代謝情況仍鮮見(jiàn)報(bào)道，鑒于D構(gòu)型氨基酸自組裝形成的多肽納米纖維正被逐步應(yīng)用到體內(nèi)研究中，有必要研究其在體內(nèi)的分布規(guī)律來(lái)進(jìn)一步指導(dǎo)其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

3.3 不同構(gòu)型多肽纖維的體內(nèi)分布差異 本文以125I為示蹤劑對(duì)比了由2種氨基酸序列相同，但部分氨基酸構(gòu)型不同的多肽所組成的納米纖維在小鼠體內(nèi)的分布規(guī)律。結(jié)果表明2種納米纖維的體內(nèi)分布存在差異，L構(gòu)型纖維主要分布于胃中，而D構(gòu)型纖維則主要分布于肝中。可能的原因是D構(gòu)型纖維體內(nèi)由于缺少相關(guān)的降解酶，因而一直維持著較大的結(jié)構(gòu)，大分子更容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）所捕獲并進(jìn)入肝中。以上結(jié)果對(duì)指導(dǎo)多肽納米纖維的體內(nèi)應(yīng)用具有一定的價(jià)值。

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