劉俊遠(yuǎn) 黃桂林 李志剛 叢竹軍 孫旭凌 祝 磊

結(jié)直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)其發(fā)病率居所有惡性腫瘤第三位[1]。在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢[2]，對患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重的影響。生長抑制因子 4（inhibitor of growth family member 4，ING4）及尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2（caudal type home?obox transcription factor 2，CDX2）是近年來新發(fā)現(xiàn)的候選抑癌基因，在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測ING4和CDX2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，初步探討其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后判斷方面的價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2007年1月—2008年4月我院經(jīng)病理確診為原發(fā)結(jié)直腸癌患者的石蠟標(biāo)本共99例，其中男51例，女48例，年齡30～85歲，平均（62.92±11.84）歲。其中結(jié)腸癌36例，直腸癌63例；高分化9例，中分化75例，低分化15例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例；T1期6例，T2期25例，T3期52例，T4期16例；Ⅰ期26例，Ⅱ期28例，Ⅲ期37例，Ⅳ期8例。所有患者均行結(jié)直腸癌根治術(shù)治療，術(shù)前均未接受放射線治療和化療，臨床及病理資料完整。術(shù)后采用電話及信訪方式進(jìn)行隨訪，起點(diǎn)為確診之日，終點(diǎn)為患者出現(xiàn)死亡、失訪或至截止時(shí)間（2013年5月30日），隨訪結(jié)束時(shí)，獲得完整隨訪資料87例，隨訪率為87.8%，35例結(jié)直腸癌患者死亡。同時(shí)選擇30例距腫瘤大于5 cm的遠(yuǎn)端正常組織作為對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人ING4多克隆抗體（ab113425）購自美國abcam公司，兔抗人CDX2單克隆抗體、Envision試劑盒及DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 石蠟包埋的結(jié)直腸癌標(biāo)本行4 μm厚連續(xù)切片，染色步驟嚴(yán)格按Envision試劑盒的操作說明進(jìn)行，ING4、CDX2抗體均按1∶200稀釋，以PBS液代替一抗做陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 由2名高年資病理科醫(yī)師在雙盲情祝下進(jìn)行染色評分。ING4陽性表達(dá)以細(xì)胞核和或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為準(zhǔn)；CDX2以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。使用半定量的評分系統(tǒng)來評估抗體的染色效果，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野或500個(gè)細(xì)胞。按染色強(qiáng)度計(jì)分:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為陽性細(xì)胞數(shù)11%～50%，3分為陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%，4分為陽性細(xì)胞數(shù)gt;75%，染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分乘積為染色評分，＜6分為陰性，≥6分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)，Kaplan-Meier乘積極限法計(jì)算累積生存率并繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)比較生存率，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ING4、CDX2在結(jié)直腸癌組和對照組中的表達(dá) 結(jié)直腸癌組ING4表達(dá)陽性率為68.8%（68/99），低于對照組的93.3%（28/30），結(jié)直腸癌組CDX2表達(dá)陽性率為72.7%（72/99），低于對照組的96.7%（29/30），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為7.346、7.764，均Plt;0.05），見圖1。

2.2 ING4、CDX2的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 不同浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期結(jié)直腸癌患者組織中ING4和CDX2的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同年齡、性別、腫瘤大小及部位結(jié)直腸癌患者組織中ING4和CDX2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Figure 1 The positive expressions of ING4 andCDX2 in colorectal cancer（immunohistochemistry,×400）圖1 結(jié)直腸癌組織中ING4、CDX2的陽性表達(dá)（免疫組化,×400）

Table 1 Relationships between expressions of ING4 and CDX2 and clinicopathological factors of colorectal cancer表1 ING4、CDX2表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系例（%）

2.3 結(jié)直腸癌組織中ING4、CDX2表達(dá)的相關(guān)關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中的ING4與CDX2表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.418，Plt;0.01）,見表2。

Table 2 The correlation between ING4 and CDX2 expressions in colorectal cancer表2 結(jié)直腸癌組織中ING4、CDX2表達(dá)的相關(guān)性

2.4 結(jié)直腸癌組織中ING4、CDX2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 ING4陰性者5年生存率為35.5%，低于ING4陽性者的77.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=16.721，Plt;0.01）；CDX2陰性者的 5年生存率為48.1%，低于CDX2陽性者的70.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=5.404，Plt;0.05），見圖2、3。

Figure 2 The survival curves of ING4 positive group and ING4 negative group in patients with colorectal cancer圖2 結(jié)直腸癌患者ING4陽性組與陰性組的生存曲線

Figure 3 The survival curves of CDX2 positive group and CDX2 negative group in patients with colorectal cancer圖3 結(jié)直腸癌患者CDX2陽性組與陰性組的生存曲線

3 討論

ING4屬于生長抑制因子家族，該家族與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修補(bǔ)及血管生成密切相關(guān)[3]。ING4廣泛參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)過程，Shiseki等[4]研究發(fā)現(xiàn)，ING4可通過上調(diào)p53的轉(zhuǎn)錄活性，打亂正常的細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞生長停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Shi等[5]發(fā)現(xiàn)：ING4可以與核因子（NF）-κB結(jié)合，引起白介素（IL）-8表達(dá)水平下降，導(dǎo)致腫瘤血管生成減少。Kim[6]研究發(fā)現(xiàn)，ING4可抑制因原癌基因MYC或MYCN過度表達(dá)引起的細(xì)胞間接觸抑制的丟失，此外，ING4能夠抑制乳腺癌細(xì)胞在軟瓊脂中的非貼壁性生長，這兩者在體外研究中均被認(rèn)為是正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志。低氧誘導(dǎo)因子（HIF）是組織細(xì)胞為適應(yīng)缺氧環(huán)境所產(chǎn)生的關(guān)鍵因子，Ozer等[7]研究發(fā)現(xiàn)ING4與HIF-1α的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示ING4可以抑制細(xì)胞對缺氧環(huán)境的適應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。ING4還可以增加腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性，Klironomos等[8]用細(xì)胞毒藥物阿霉素和鬼臼乙叉甙處理外源性ING4基因感染的HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示ING4能提高HepG2細(xì)胞對阿霉素、鬼臼乙叉甙的化療敏感性。ING4在正常組織中表達(dá)豐富，但在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)，有研究顯示其在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為54.5%[9]，在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率為63.3%[10]。本研究結(jié)直腸癌組織中ING4陽性表達(dá)率為68.8%，低于遠(yuǎn)端正常組織，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示ING4低表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明ING4與腫瘤的惡性程度關(guān)系密切，并參與了腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移；此外，ING4陰性表達(dá)組的5年生存率明顯低于陽性表達(dá)組，提示ING4表達(dá)缺失的結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。

CDX2是一種特異性核轉(zhuǎn)錄因子，在鑒別腸源性腫瘤方面有重要價(jià)值。近年來CDX2的抑癌作用也越來越受到人們關(guān)注，研究表明CDX2能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,降低腫瘤的惡性程度，Gross等[11]通過RNA干擾技術(shù)阻止結(jié)腸癌細(xì)胞中CDX2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)CDX2的表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。任海亮等[12]將含CDX2的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞株，然后將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CDX2的單克隆LoVo細(xì)胞株植于裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)CDX2在Lo?Vo細(xì)胞中的過表達(dá)能夠抑制移植瘤的生長。Zheng等[13]通過檢測結(jié)直腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系（SW480和LS174T）中CDX2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CDX2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯低于正常結(jié)直腸組織，而且隨著結(jié)直腸癌分化程度降低，CDX2蛋白的表達(dá)明顯減少，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CDX2蛋白的表達(dá)明顯少于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，CDX2在結(jié)直腸癌DukesA期到D期的表達(dá)依次減少。本研究CDX2蛋白在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率為72.7%,低于癌旁正常結(jié)直腸組織，與國內(nèi)外報(bào)道結(jié)論一致；且CDX2表達(dá)水平和組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期關(guān)系密切，CDX2陰性表達(dá)組的5年生存率明顯低于陽性表達(dá)組，提示CDX2表達(dá)減少，腫瘤的惡性程度增高，易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后差。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一種多步驟、多階段復(fù)雜的過程，其中包括多種因子的相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)，ING4基因與NF-κB的結(jié)合，除了影響IL-8的表達(dá)，還可以抑制NF-κB調(diào)節(jié)基因環(huán)氧化酶（COX）-2的轉(zhuǎn)錄[14]，COX-2在腫瘤血管生成及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多個(gè)過程中發(fā)揮了重要作用。而Mutoh等[15]在體外人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)CDX-2有類似功能，CDX2可以通過阻礙NF-κB-DNA復(fù)合物的形成抑制COX-2 mRNA及其蛋白轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，提示ING4和CDX-2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中相互作用，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中ING4和CDX2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，且均與預(yù)后有關(guān)，提示兩者可能在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中相互影響、共同促進(jìn)，兩者聯(lián)合檢測可作為評價(jià)結(jié)直腸癌惡性程度和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。

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