李 娟 劉風(fēng)林 張書紅

我國是人巨細胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染的高發(fā)流行地區(qū)[1]。除先天性感染外，經(jīng)產(chǎn)道傳播、母乳傳播、家庭內(nèi)傳播亦是嬰幼兒感染HCMV的重要途徑[2]。HCMV感染臨床表現(xiàn)無特異性，且存在潛伏性感染，從輕微無癥狀感染直到嚴重缺陷或死亡。因而早期診斷、早期治療對預(yù)后至關(guān)重要。但目前DNA-PCR檢測HCMV只能證明病毒存在，并不能反映病毒復(fù)制。HCMV基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IE mRNA及pp67 mRNA的檢測已應(yīng)用于器官移植后患者是否存在HCMV活動性感染的早期診斷[3-4]，并已作為HCMV宮內(nèi)活動性感染的特異性指標[5]，但尚少見針對嬰幼兒HCMV感染者的研究。本研究擬通過對HCMV基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IE mRNA和pp67 mRNA的檢測，探討mRNA表達是否可以作為嬰幼兒HCMV感染的診斷方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年5月—2011年11月我院消化科收治的以黃疸、肝脾腫大、發(fā)熱、咳喘、腹瀉、抽搐為主要癥狀的1～6個月患兒。入院后行肝功能，血、尿、痰CMV-DNA，CMV-IgM，CMVpp67檢測。選擇結(jié)果滿足血、尿、痰CMVDNA拷貝數(shù)增高、血CMV-IgM、CMVpp67檢測呈陽性中任意一項同時除外其他病毒感染者入陽性組，共105例。并進一步行頭CT、聽力及眼底檢查，綜合臨床癥狀體征及各項檢查結(jié)果做出判斷。而血、尿、痰CMV-DNA拷貝數(shù)增高，血CMV-IgM、CMVpp67檢測均呈陰性,同時除外其他病毒感染者列入陰性組，共98例。2組間月齡、性別和體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

Tab.1 General information of infants who were either positive or negative of CMV infection with current clinic diagnosis standards表1 陽性組與陰性組患兒一般情況比較

1.2 實驗材料與試劑 RNA抽提試劑盒及實時熒光定量（real-time）PCR反應(yīng)試劑盒（QIAGEN，Germany）。Real-time PCR儀及數(shù)據(jù)分析軟件（ABI 7500，Life Technologies，US）。

1.3 方法

1.3.1 生化指標的檢測 所有患兒抽取股靜脈血1～2 mL，TBIL、DBIL、ALT及ALP指標均采用試劑盒進行檢測，而HC?MV-DNA則采用裂解液破碎細胞，使得病毒顆粒游離，然后14 000×g離心10 min，取上清，利用熒光定量方法對病毒DNA拷貝數(shù)進行定量檢測。

1.3.2 cDNA的合成 參照參考文獻[4]，采用Trizol方法抽提血清樣本總RNA，并用紫外分光光度計檢測RNA的濃度與純度，檢測光密度（OD）260/OD280數(shù)值在1.8～2.0之間時，證明提取的RNA純度適合于進行下一步實驗。4 μg總RNA于80μL反應(yīng)體系，混勻后，1 000 r/min離心30 s，65℃水浴5 min后立即置于冰浴1 min。1 000 r/min離心30 s，冰浴中依次加入：5×First-strand buffer，0.1 mol/L MDTT，RNase抑制劑（40 U/μL）?；靹颍?5℃孵育10 min，37℃孵育2 min。各管中分別加入4μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200 μL），混勻后短暫離心，37℃水浴50 min。70℃水浴15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性終止反應(yīng)，–20℃保存樣品cDNA。

1.3.3 Real-time PCR 試驗流程參照參考文獻[4]。IE及pp67基因的PCR引物設(shè)計見表2。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性60 s；95 ℃ 10 s、退火溫度58 ℃ 10 s、72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)。溫度變化速度為20℃/s，在每個循環(huán)的延伸末檢測熒光信號。隨后是一個緩慢升溫的程序：65℃15 s，95℃10 s，溫度變化速度為0.1℃/s，同時連續(xù)檢測DNA逐漸變化過程中熒光信號的變化情況，繪制PCR產(chǎn)物的熔解曲線（melting curve），以了解樣品擴增的特異性，保障測定結(jié)果的準確可靠。本研究中將各待測基因的PCR擴增CT值與相對應(yīng)的βactin的PCR擴增CT值相減得到△CT來進行標準化，以2-△CT計算得出各待測基因產(chǎn)物的相對定量，每管樣品重復(fù)測定3次。根據(jù)基因相對表達量，樣本IE及pp67的相對表達數(shù)值高于對照組5倍以上被認為是高表達，5倍以下被認為是低表達。

Tab.2 Primers for real-time PCR表2 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，比較采用t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基線資料 傳統(tǒng)方法檢測TBIL、DBIL、ALT、ALP和HCMV-DNA拷貝數(shù)陽性組均高于陰性組（P＜0.01），見表1。

2.2 IE mRNA及pp67mRNA在常規(guī)診斷HCMV陽性和陰性患兒中的表達 常規(guī)診斷的陰性組中亦有IE mRNA陽性表達患者，但陽性率顯著低于陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

Tab.3 IE and pp67 transcription in the infants who were CMV positive with current clinic standards表3 2組間IE及pp67 mRNA陽性表達結(jié)果例（%）

2.3 IE及pp67 mRNA表達在常規(guī)診斷HCMV陽性患兒中的分布規(guī)律 105例陽性患兒中，72例IE高表達，33例IE低表達。IE與pp67表達呈現(xiàn)交錯進行的表達趨勢，即IE表達升高，pp67表達呈現(xiàn)較低的狀態(tài)，見表4。

2.4 IE及pp67 mRNA表達在常規(guī)診斷HCMV陰性患兒中的分布規(guī)律 HCMV陰性組患兒中盡管也檢測到IE的表達（0.23±0.03），但是表達量顯著低于IE低表達組（1.03±0.14），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.215，P＜0.05）。陰性組患兒未檢測到pp67的表達。

Tab.4 Relative mRNA transcription profile of IE and pp67 genes in the HCMV-positive samples diagnosed by routine method表4 陽性組患兒中IE及pp67基因mRNA相對表達量比較

3 討論

本研究主要對來我院就診的常規(guī)診斷HCMV陽性或陰性患兒血液中的HCMV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達進行分析，結(jié)果表明，病毒轉(zhuǎn)錄早期和晚期的mRNA均在陽性患兒中表達，部分患兒就診時體內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)pp67 mRNA表達，提示已經(jīng)處于病毒感染晚期。在傳統(tǒng)檢測陰性的患兒中，筆者也檢測到有IE mRNA的表達，說明現(xiàn)有診斷方法的靈敏度不足，提示這部分患兒也應(yīng)該進行適當?shù)闹委煛?/p>

目前我國嬰幼兒感染HCMV的傳統(tǒng)診斷方法是基礎(chǔ)病毒DNA擴增的檢測手段，判斷是否感染該病毒。但是傳統(tǒng)的DNA擴增手段只能通過明確基因拷貝數(shù)的多少來判斷感染情況，對于早期感染及病毒復(fù)制情況，并無法進行有效地判斷，影響了疾病的治療。因此，目前開發(fā)新的檢測手段是國際該領(lǐng)域的研究熱點[5-6]。

在既往研究中，IE mRNA和pp67 mRNA檢測已經(jīng)在腎臟移植后是否出現(xiàn)HCMV感染鑒定中被應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，IE mRNA出現(xiàn)時間顯著早于pp67 mRNA，提示IE mRNA是早期發(fā)現(xiàn)HCMV感染，并作出診療方案的重要依據(jù)[7]。同時，Pairoj等[8]發(fā)現(xiàn)，利用PCR方法檢測pp67的表達，較傳統(tǒng)的DNA-PCR方法更為敏感。Bergallo等[9]發(fā)現(xiàn)利用熒光定量PCR在HCMV-DNA拷貝數(shù)在100個時即可檢測到。上述研究結(jié)果與筆者的結(jié)果是一致的，表明mRNA檢測對于判斷HCMV感染更加準確和靈敏。但不同的是，本研究利用了兩種mRNA共表達的檢測手段，通過分析每一種mRNA的相對表達量，達到更加準確地判斷HCMV感染時期的目的。

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