劉 捷 (洛陽新區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科，河南 洛陽 471023)

慢性炎癥在Alzheimer病(AD)的神經(jīng)病理中起一定的作用。白介素(IL)-1與淀粉樣β蛋白(Aβ)相關(guān)〔1〕，IL-1刺激淀粉樣前蛋白(APP)的合成和mRNA的翻譯〔2〕。血細(xì)胞表達(dá)APP mRNA和蛋白增加來自AD患者的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的APP mRNA增加〔3〕，這可能與潛在的腦內(nèi)異常的淀粉樣沉積有關(guān)〔4〕。另一方面，Aβ刺激培養(yǎng)的人單核細(xì)胞產(chǎn)生和釋放IL-1β和IL-1受體拮抗劑(IL-1RA)。AD病人的淋巴細(xì)胞對Aβ刺激反應(yīng)低表明T細(xì)胞無能〔5〕。這些研究表明從腦到外周存在炎癥信號途徑，但是誘導(dǎo)的機(jī)制不清楚。本研究旨在分析不同老年人群的PBMC對不同刺激產(chǎn)生的反應(yīng)，以確定細(xì)胞對環(huán)境的相對影響，研究炎癥因子在AD致病機(jī)制和診斷中的作用。

1 材料和方法

1.1 對象 血液標(biāo)本來自24名輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)患者，平均年齡(75.06 ± 1.34)歲，男12例，女12例;8例輕度AD病人和20名健康的老年人〔年齡(73.10 ±1.57)歲〕。MCI和對照組年齡無顯著差異。但是，輕度AD患者比對照組的年齡大(P＜0.05)。所有研究對象均進(jìn)行體檢，包括血液檢查、MRI和迷你精神狀態(tài)檢查(MMSE)，邏輯記憶Ⅰ、Ⅱ試驗和臨床癡呆分析(CDR)。MCI的分類依據(jù)邏輯記憶Ⅱ的異常記憶或一個CDR的分?jǐn)?shù)確定(用于區(qū)別MCI和AD)。排除神經(jīng)疾病、頭部受傷史、DSM-IV抑郁癥、任何不穩(wěn)定的醫(yī)學(xué)狀態(tài)、嗜酒和吸毒者。排除服用神經(jīng)松弛劑、慢性抗焦慮劑和鎮(zhèn)靜劑。本研究得到了醫(yī)院倫理委員會的同意，與患者本人或監(jiān)護(hù)人簽訂了知情同意書。

1.2 細(xì)胞分離和培養(yǎng)條件 血液標(biāo)本用10 ml肝素抗凝管收集。用Ficoll-Hypaque密度梯度分離液離心分離PBMCs，并以106細(xì)胞/ml含10%胎牛血清、非必需氨基酸、1 mmol/L丙酮酸鈉、50 U/ml青霉素和50 mg/ml鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在12孔板中。細(xì)胞在37℃，5%CO2完全培養(yǎng)基或用2 μg/ml植物血凝素(PHA)或10 μg/ml脂多糖(LPS)培養(yǎng)24 h或48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并保存在-70℃冰箱。

1.3 ELISA檢測培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子 采用ELISA試劑盒(上?？迫A生物技術(shù)有限公司)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-12p70，腫瘤壞死因子(TNF)-α，IL-10，IL-6，IL-1β 和 IL-8 濃度，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，并計算IL-1β/IL-10、IL-6/IL-10、TNF-α/IL-10、IL-8/IL-10 的比值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0.1軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較用U檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組 IL-12p70，TNF-α，IL-10，IL-6，IL-1β 及 IL-8 比較PHA刺激PBMCs 24 h后產(chǎn)生的IL-6、IL-8和IL-10水平MCI組顯著高于對照組(均P＜0.05)，但培養(yǎng)48 h后這種差異消失。當(dāng)LPS刺激PBMCs時，不同組間絕對細(xì)胞因子濃度沒有顯著性差異;但是MCI組與對照組相比TNF-α/IL-10、IL-6/IL-10和IL-8/IL-10水平顯著降低(P ＜0.05或P ＜0.01)。見表1，表2。

2.2 血漿中IL-6、IL-8和 IL-10的濃度 對照組IL-8水平為(10.7 ±4.2)pg/ml，MCI組 IL-8 水平為(6.4 ±2.6)pg/ml，輕度AD 組 IL-8水平為(9.4 ±4.7)pg/ml，對照組、MCI和輕度 AD患者血漿IL-8水平無顯著差異(P＞0.05)。各組的血漿中沒有檢測到IL-6和IL-10，可能低于試劑盒的檢測限。

表1 PHA或LPS刺激PBMCs 24 h或48 h產(chǎn)生的細(xì)胞因子〔均數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差)〕

3 討論

在對健康老年人、MCI和AD患者外周血培養(yǎng)的PBMCs產(chǎn)生的細(xì)胞因子的研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PBMCs細(xì)胞用PHA刺激24 h后，來自MCI的PBMCs產(chǎn)生的 IL-6、IL-8和IL-10顯著高于對照組，但是刺激48 h則不存在這種情況?？赡芤驗镻HA刺激48 h后細(xì)胞因子的釋放達(dá)到一個平臺，或MCI患者的PBMCs更容易受刺激而產(chǎn)生細(xì)胞因子，而對照組的PBMCs需要經(jīng)過一段時間刺激后才能產(chǎn)生與MCI組類似水平;發(fā)現(xiàn)抗炎因子IL-10也增加，可能是對前炎癥因子IL-6和IL-8的增加作出的反應(yīng)〔6〕。在不同的時間點檢測用LPS刺激后絕對細(xì)胞因子的濃度，組間沒有顯著性差異。但是，MCI與對照比較，LPS刺激4 h后導(dǎo)致 TNF-α/IL-10，IL-6/IL-10和 IL-8/IL-10的比值降低，這表明對IL-10反應(yīng)的炎癥因子較快產(chǎn)生反應(yīng)而減少。這與同PHA的刺激可以比較。孵育15 h后PHA刺激淋巴細(xì)胞增殖，增加DNA聚合酶的活性，而LPS刺激單核細(xì)胞釋放IL-1和TNF-α〔7〕。PHA和LPS不同的影響表明MCI患者免疫細(xì)胞類型發(fā)生了改變，因而產(chǎn)生的細(xì)胞因子也發(fā)生變化。

Lindberg等〔8〕已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在AD早期和晚期可溶性IL-1受體Ⅱ(sIL-1RⅡ)在腦脊液和血清中沒有差異，表明在AD早期和晚期IL-1系統(tǒng)沒有受到損害。本研究結(jié)果與之一致，另外本研究表明LPS不是PHA刺激PBMCs產(chǎn)生相對較高的IL-10。重度AD病人外周血用LPS刺激減少IL-1β、IL-6、和TNF-α的釋放，但與輕度和中度AD患者以及對照沒有差異〔9〕，即在AD病人中早期斑塊相關(guān)的小神經(jīng)膠原細(xì)胞增加IL-1α的表達(dá)，但在AD后期則下降，表明小膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞核炎癥在斑塊發(fā)展的早期起作用。

本研究結(jié)果顯示MCI病人中PBMCs產(chǎn)生的細(xì)胞因子在臨床AD之前已發(fā)生改變。但是，這可能不能完全用前炎癥的改變來解釋，因為用PHA刺激細(xì)胞抗炎因子IL-10隨著IL-6和IL-8增加而增加。而在PHA刺激因子產(chǎn)生的趨勢似乎在MCI患者達(dá)到高峰，然后一旦進(jìn)展到早期AD，則產(chǎn)生的細(xì)胞因子回到對照組的水平或以下。據(jù)報道〔10〕在AD發(fā)展之前可見到腦脊髓膜內(nèi)的炎癥，但與嚴(yán)重的AD和脈管性癡呆比較，血清TNF-α的水平在輕度-中度AD顯著性降低，表明在不同的AD階段和其他癡呆類型之間有不同的細(xì)胞因子譜，這與本研究結(jié)果一致。

對TNF-α和IL-1反應(yīng)釋放的IL-6在血漿中持續(xù)時間較長，所以是一種前炎癥細(xì)胞因子活化的有用指示〔11〕。由于MCI人群的異質(zhì)性導(dǎo)致IL-6的結(jié)果波動很大，從而阻止IL-6作為MCI的生物標(biāo)志物。Aβ刺激小膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-1、TNF-α和IL-8，不是IL-10。在外周血單個核細(xì)胞中，Aβ刺激IL-1β、IL-1Rα 的釋放，不是 IL-6，IL-10和 TGF-β。來自 AD 患者的B細(xì)胞被證明產(chǎn)生Aβ反應(yīng)性的自身抗體。小鼠顱內(nèi)注射Aβ能引起腦和血漿中IL-6的增加，表明Aβ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的沉積引起外周免疫反應(yīng)的改變。而且，表達(dá)人APP的轉(zhuǎn)基因小鼠能減少對Aβ引起的淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生〔12〕。與對照比較來自AD患者的淋巴細(xì)胞對淀粉樣多肽的刺激較少產(chǎn)生反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)意味著慢性的Aβ刺激導(dǎo)致的對Aβ的細(xì)胞免疫反應(yīng)可能加重它在AD患者腦內(nèi)的積聚。

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