王 浩 李玉琴 高永峰 辛?xí)悦?徐曉燕 高允生 (泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016)

丹參是常用的活血化淤中藥。白花丹參為唇形科植物丹參的白花變型，以根入藥，是山東道地藥材之一，屬瀕危珍稀藥用植物。多年來(lái)，人們對(duì)紫花丹參研究較多，而對(duì)于白花丹參的研究仍處于起步階段〔1〕。臨床上丹參以生品和炮制品入藥〔2〕。丹參炮制入藥自唐代就有“熬令紫色”;宋代有炒炙、焙制;明清代有酒洗、酒浸、酒炒、酒蒸、豬血拌炒。目前丹參的炮制方法主要有酒炙、炒炭、麩炒、豬血制、醋制等〔3〕。隨著炮制方法不同，其化學(xué)成分也發(fā)生了變化。生丹參主治溫?zé)岵崛霠I(yíng)血，所致心肌怔仲、失眠等癥，如《溫病條辨》清營(yíng)湯。制丹參主要用于氣滯血瘀、心胃諸痛等，如《時(shí)方歌括》丹參飲;胸憋悶、心絞痛，如《中國(guó)藥典》(2005)復(fù)方丹參片〔4〕;氣滯血瘀、胸悶、心悸氣短，如《中國(guó)藥典》(2005)冠心丹參片〔4〕。目前對(duì)于白花丹參是否具有抗心肌缺血作用，不同的炮制方法是否對(duì)這個(gè)作用存在影響還鮮見報(bào)道。因此，本研究采用不同的方法炮制白花丹參，并提取其中的水溶性成分，通過(guò)多種模型觀察其對(duì)小鼠心肌缺血缺氧的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 白花丹參原藥由泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥材栽培基地種植，于秋季取樣，經(jīng)藥物分析教研室李玉琴博士鑒定。取原藥去雜質(zhì)及莖葉，取其根切片進(jìn)行酒炙與炒炭。酒炙白花丹參:取丹參片，加入定量黃酒拌勻，稍悶潤(rùn)，待酒被吸盡后，置炒制容器用文火加熱，炒干，取出晾涼，粉碎，過(guò)二十目篩;炒炭白花丹參:取丹參片，置炒制容器內(nèi)，用武火加熱，炒至表面焦黑色，內(nèi)部焦褐色，取出晾涼，粉碎，過(guò)二十目篩。取酒炙白花丹參、炒炭白花丹參及生品白花丹參加入蒸餾水煎煮3次(W/V=1∶5)，每次武火煮沸后，文火微沸30 min，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮適當(dāng)濃度備用。異丙腎上腺素購(gòu)于上海禾豐制藥有限公司。垂體后葉素注射液購(gòu)于蚌埠市宏業(yè)生化制藥廠;復(fù)方丹參片購(gòu)于山東仙河藥業(yè)有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所(批號(hào):20100317)。

1.2 白花丹參生品、酒制品及炒炭品中丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A的含量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)〔5〕所述的方法，測(cè)定了白花丹參3種炮制品種4種水溶性成分的含量，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 白花丹參3種炮制品中四種水溶性成分的含量(s)

表1 白花丹參3種炮制品中四種水溶性成分的含量(s)

炮制品 丹參素(mg/g)原兒茶醛(mg/g)丹酚酸B(mg/g)丹酚酸A(mg/g)

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物耐低氧與耗氧量動(dòng)態(tài)變化同步測(cè)定裝置〔6〕(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制備，專利號(hào)CN2698274);BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟生物科技有限公司);紫外分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雌雄各半，18～22 g，購(gòu)于泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):魯動(dòng)質(zhì)字020103。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及方法

1.5.1 白花丹參不同炮制品水提物對(duì)異丙腎上腺素致心肌缺氧小鼠存活時(shí)間的影響 取小鼠隨機(jī)分為9組，各10只，即空白組、模型組、復(fù)方丹參片組(3.6 g·kg-1·d-1)、生品白花丹參水提物高、低劑量組，酒炙白花丹參水提物高、低劑量組，炒炭白花丹參水提物高、低劑量組，劑量分別為30、20 g/kg。各給藥組灌胃相應(yīng)劑量藥物，而空白組及模型組灌胃等容量蒸餾水，1次/d，連續(xù)5 d。末次給藥1 h后，除空白組皮下注射等容量生理鹽水外，余組皮下注射異丙腎上腺素20 mg/kg，15 min后將小鼠放入裝有鈉石灰的小動(dòng)物耐低氧與耗氧量動(dòng)態(tài)變化同步測(cè)定裝置中，密閉裝置，記錄小鼠存活時(shí)間。

1.5.2 白花丹參不同炮制品水提物對(duì)夾閉氣管小鼠心電維持時(shí)間的影響 取小鼠隨機(jī)分為8組，各8只，即空白組，復(fù)方丹參片組(3.6 g/kg)、藥物干預(yù)分組及給藥劑量同上。除空白組灌胃等容量蒸餾水，余組給予相應(yīng)劑量藥物，1次/d，連續(xù)5 d。末次給藥1 h后皮下注射烏拉坦(1.3 g/kg)麻醉、固定，BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)描記小鼠標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，記錄一段正常心電圖后，動(dòng)脈夾夾閉氣管，記錄小鼠心電維持時(shí)間(s)。

1.5.3 酒炙白花丹參水提物對(duì)垂體后葉素誘導(dǎo)小鼠心肌缺血的影響 小鼠于實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行篩選，剔除心電圖(ECG)異常者。取ECG正常小鼠分為5組各10只，即對(duì)照組、模型組、酒炙白花丹參水提物高、低劑量組(30 g/kg、20 mg/kg)，復(fù)方丹參片組(3.6 g/kg)，空白組及模型組給予等容量蒸餾水，1次/d，連續(xù)2 w。末次給藥1 h后皮下注射烏拉坦(1.3 g/kg)麻醉、固定，BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)描記小鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，除空白組小鼠尾靜脈注射等容量的生理鹽水外，余組尾靜脈注射垂體后葉素(30 U/kg)。連續(xù)記錄給藥后 10、30 s、1、2、5、10、20、30 min時(shí)ECG，以PR段為基線記錄各組小鼠J點(diǎn)位移絕對(duì)值(mV)及心率的變化，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)3個(gè)連續(xù)的波型，取其平均值。給予垂體后葉素30 min后，各組小鼠摘眼球取血，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清LDH、CK的活性。取心臟制成組織勻漿，取上清液，參照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定心肌組織MDA、NO含量及SOD活力，考馬斯亮藍(lán)測(cè)定組織中蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 白花丹參不同炮制品水提物對(duì)異丙腎上腺素致缺氧小鼠存活時(shí)間及夾閉氣管小鼠心電維持時(shí)間的影響 與空白組相比，模型組小鼠缺氧存活時(shí)間明顯縮短(P＜0.01)。而生品低劑量組，酒炙高、低劑量組能明顯延長(zhǎng)小鼠缺氧存活時(shí)間(P＜0.05)，提高小鼠15 min和20 min的存活率，且生品低劑量組、酒炙高劑量組作用優(yōu)于復(fù)方丹參片組。與空白組相比〔(367.13±59.24)s〕，生品高劑量組、酒炙低、高劑量組、炒炭低劑量組和復(fù)方丹參片組能明顯延長(zhǎng)夾閉氣管小鼠心電維持時(shí)間 〔(759.17 ± 250.57)s，(651.29 ± 241.35)s，(672.43±105.90)s，(596.00±160.53)s，(717.50±263.75)s，P＜0.05〕，生品低劑量組、炒炭高劑量組小鼠心電維持時(shí)間無(wú)明顯改變〔(553.4±99.28)s、(417.25±156.58)s，P＞0.05〕。見表 2。

表2 白花丹參不同炮制品水提物對(duì)異丙腎上腺素致缺氧小鼠存活率〔n(%)〕及存活時(shí)間(s)的影響

表2 白花丹參不同炮制品水提物對(duì)異丙腎上腺素致缺氧小鼠存活率〔n(%)〕及存活時(shí)間(s)的影響

與空白組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

組別 n 15 min 20 min 存活時(shí)間(min)空白組 10 10(100.00)9(90.00)23.10±2.693)模型組 10 4(40.00)0(0.00)15.00±1.60生品低劑量組 9 6(66.67)3(33.33)19.50±1.391)生品高劑量組 8 5(62.50)0(0.00)17.00±1.41酒炙低劑量組 10 9(90.00)2(20.00)18.25±4.892)酒炙高劑量組 10 9(90.00)4(40.00)19.12±3.231)炒炭低劑量組 9 6(66.60)0(0.00)14.56±1.59炒炭高劑量組 8 6(75.00)1(12.50)17.25±5.63復(fù)方丹參片組 10 9(90.00)1(10.00)18.19±2.072)

2.2 酒炙白花丹參水提物對(duì)心肌缺血小鼠心電圖的影響 與空白組相比，模型組小鼠藥后30 s心率明顯減慢(P＜0.01)，10 min后恢復(fù);而藥后10 s即可引起J點(diǎn)明顯上抬、位移絕對(duì)值提高(＞0.1 mV)(P＜0.01)，5 min 后恢復(fù)，說(shuō)明垂體后葉素能引起心肌缺血。酒炙白花丹參水提物高、低劑量組及復(fù)方丹參片組均能顯著對(duì)抗垂體后葉素所致的心率減慢及J點(diǎn)的改變(P＜0.05)。結(jié)果見表 3、表4。

表3 酒炙白花丹參水提物對(duì)心肌缺血小鼠心率的影響(n=10，s)

表3 酒炙白花丹參水提物對(duì)心肌缺血小鼠心率的影響(n=10，s)

與空白組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與模型組比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05

組別 10 s 30 s 1 min 2 min 5 min 10 min 20 min 30 min空白組 523.57±70.81 517.00±64.58 535.00±63.13 536.50 ± 88.75 540.50±84.60 534.66±80.70 510.33±77.44 489.16±82.17模型組 466.71±91.66 277.00±155.471)323.38±81.231)364.50±100.831)409.50±118.702)491.00±154.87 530.13±125.23 562.63±35.97酒炙低劑量組 518.00±105.93 427.17±113.214)479.14±106.994)506.17±114.154)553.50±87.374) 520.83±78.32 505.14±63.58 515.00±62.93酒炙高劑量組 502.57±153.04 432.00±60.744)508.67±102.933)513.00±109.813)550.57±99.974) 531.71±85.65 520.32±92.62 516.83±107.35復(fù)方丹參片組 478.00±78.59 463.33±47.303) 490.17±78.544)496.50±108.874)507.33±91.174) 511.00±82.51 510.67±74.48 500.66±82.33

表4 酒炙白花丹參水提物對(duì)心肌缺血小鼠心電圖J點(diǎn)位移絕對(duì)值的影響(n=10，s)

表4 酒炙白花丹參水提物對(duì)心肌缺血小鼠心電圖J點(diǎn)位移絕對(duì)值的影響(n=10，s)

與空白組比較:1)P＜0.01，與模型組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

組別 10 s 30 s 1 min 2 min 5 min 10 min 20 min 30 min空白組 0.020 8±0.010 4 0.023 3±0.007 6 0.030 8±0.006 2 0.024 5±0.011 7 0.048 5±0.017 7 0.023 8±0.009 7 0.061 5±0.020 8 0.063 3±0.017 9模型組 0.329 6±0.052 81)0.153 1±0.021 51)0.117 1±0.029 61)0.069 5±0.020 5 0.035 0±0.011 3 0.033 9±0.011 8 0.066 5±0.015 3 0.052 5±0.019 1酒炙低劑量組 0.290 5±0.034 7 0.114 8±0.034 3 0.076 7±0.020 63)0.047 5±0.034 0 0.045 2±0.014 0 0.017 4±0.007 1 0.066 8±0.012 3 0.051 2±0.026 5酒炙高劑量組 0.201 1±0.020 02)0.090 4±0.024 42)0.068 0±0.029 72)0.057 2±0.038 0 0.498 6±0.024 8 0.031 3±0.011 8 0.050 8±0.014 7 0.048 5±0.015 6復(fù)方丹參片組 0.231 1±0.033 93)0.103 5±0.020 43)0.078 7±0.021 23)0.055 0±0.015 9 0.056 3±0.014 8 0.043 1±0.017 6 0.044 8±0.020 2 0.054 8±0.033 0

2.3 酒炙白花丹參水提物對(duì)心肌缺血小鼠血清生化指標(biāo)的影響 與空白組相比，模型組小鼠血清LDH和CK活性顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比，酒炙白花丹參水提物高、低劑量組LDH 活性明顯降低(P＜0.05、0.01)，僅高劑量組能明顯降低CK 活性(P＜0.01)。見表5。

2.4 酒炙白花丹參對(duì)心肌缺血小鼠心肌組織生化指標(biāo)的影響

與空白組相比，模型組小鼠心肌組織中MDA含量升高，SOD活力及 NO 含量均明顯下降(P＜0.05、P＜0.01)。與模型組相比，酒炙白花丹參水提物高、低劑量組MDA水平顯著降低，SOD活力及 NO 含量明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。見表6。

表5 酒炙白花丹參水提物對(duì)心肌缺血小鼠血清LDH和CK活性的影響(s，n=10)

表5 酒炙白花丹參水提物對(duì)心肌缺血小鼠血清LDH和CK活性的影響(s，n=10)

與空白組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

組別 LDH(U/L)CK(U/ml)空白組 5 899.30±537.91 0.99±0.48模型組 8 933.98±1955.081) 3.20±0.851)酒炙低劑量組 7 356.06±1049.332) 2.58±0.83酒炙高劑量組 7 236.11±753.363) 1.85±0.582)復(fù)方丹參片組 6 602.81±729.712) 1.79±0.602)

表6 酒炙白花丹參水提物對(duì)心肌缺血小鼠心肌組織中SOD活性和MDA、NO水平的影響(s，n=10)

表6 酒炙白花丹參水提物對(duì)心肌缺血小鼠心肌組織中SOD活性和MDA、NO水平的影響(s，n=10)

與空白組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與模型組比較:3)P＜0.01

組別MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)NO(μmol/mgprot)空白組 34.43±13.63 184.62±41.44 0.19±0.07模型組 61.67±15.991) 123.47±17.981) 0.10±0.012)酒炙低劑量組 45.43±14.512) 168.39±35.712) 0.21±0.103)酒炙高劑量組 35.02±6.543) 176.25±41.882) 0.13±0.01復(fù)方丹參片組 38.63±17.043) 189.65±40.423) 0.20±0.073)

3 討論

缺氧是一種緊張性刺激，可引起機(jī)體產(chǎn)生各種應(yīng)激性反應(yīng)，影響機(jī)體各種代謝，特別是影響機(jī)體的氧化供能，最終導(dǎo)致機(jī)體的心腦等重要器官缺氧供能不足而死亡〔7，8〕。異丙腎上腺素皮下注射可造成心肌細(xì)胞缺血缺氧損傷，是一種常用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性心肌缺血模型。本研究結(jié)果顯示，酒炙白花丹參水提物高、低劑量組均可明顯延長(zhǎng)小鼠耐缺氧存活時(shí)間，明顯提高15、20 min小鼠的存活率，雖生品白花丹參水提物低劑量組也可延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，但對(duì)于小鼠存活率的影響不如酒炙白花丹參水提物明顯。對(duì)于夾閉氣管小鼠心電維持時(shí)間的影響，酒炙白花丹參水提物高、低劑量組均具有延長(zhǎng)作用，生品高劑量組及炒炭低劑量組白花丹參水提物也可延長(zhǎng)小鼠心電維持時(shí)間，但與酒炙白花丹參低劑量組無(wú)差異。綜合以上，本課題組又進(jìn)一步對(duì)酒炙白花丹參水提物的抗心肌缺血作用進(jìn)行了研究。推測(cè)出現(xiàn)此結(jié)果的可能原因，與經(jīng)不同的方法炮制后提取物的成分及含量不同有關(guān)。本課題組對(duì)3個(gè)炮制品水溶性分丹參素、丹酚酸B、丹酚酸A、原兒茶醛進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示酒炙白花丹參水提物中包含丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B 3種成分，尤其丹酚酸B含量較高。丹酚酸B能夠增加冠脈流量，還具有纖溶、保護(hù)血管內(nèi)皮、抗氧化作用丹參素、原兒茶醛，是丹參中發(fā)揮抗心肌缺血作用的主要成分。有研究發(fā)現(xiàn)〔9〕，丹酚酸B的抗氧化作用明顯強(qiáng)于丹參素及原兒茶醛。但對(duì)于進(jìn)一步機(jī)制還有待研究。

垂體后葉素可引起冠狀動(dòng)脈痙攣，造成急性心肌供血不足，同時(shí)收縮全身小血管，增加外周阻力進(jìn)而增加心臟后負(fù)荷，因此注射垂體后葉素可致動(dòng)物發(fā)生急性心肌缺血，是常用的心肌缺血模型之一。ECG J點(diǎn)及心率是判斷心肌缺血發(fā)生與否的一個(gè)重要指標(biāo)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，尾靜脈注射垂體后葉素后，J點(diǎn)位移增高、心率減慢，提示發(fā)生心肌缺血。而酒炙白花丹參低、高劑量對(duì)急性心肌缺血ECG J點(diǎn)及心率的改變有明顯的改善作用，提示該藥物對(duì)缺血心肌具有明確的保護(hù)作用，能夠改善心肌供血供氧，維護(hù)心功能。缺血性心肌酶的釋放量是心肌損害程度的主要標(biāo)志，也是判斷細(xì)胞從可逆到不可逆損傷的重要標(biāo)志。心肌細(xì)胞的缺血缺氧使細(xì)胞膜的完整性受損，膜通透性增加，引起心肌酶釋放增多，使血清中酶活力升高 ，造成心肌細(xì)胞代謝紊亂〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒炙白花丹參可減輕細(xì)胞膜的損傷程度，減少心肌酶的釋放，保護(hù)心肌細(xì)胞。NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞利用L-精氨酸在NOS作用下合成的具有擴(kuò)張血管作用的內(nèi)源性物質(zhì)，被認(rèn)為是內(nèi)源性的心臟保護(hù)物質(zhì)〔12〕。本實(shí)驗(yàn)觀察到酒炙白花丹參水提物可顯著抑制心肌缺血后NO含量的降低，提示其抗心肌缺血作用可能與NO有關(guān)。

總之，白花丹參不同炮制品水提物均有不同程度的耐缺氧作用，其中酒炙白花丹參水提物效果較好，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，酒炙白花丹參水提物具有明顯的抗心肌缺血作用，可能與其具有抗氧化、影響NO有關(guān)。

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