李日恒 張 嬌 李山峰 溫聰娜 劉 博 康 然 耿 艷 馬 芳 彭新宇 劉 茜 滑志娟 張愛民

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，河北 保定 071000)

survivin基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，沉默survivin在體外結(jié)直腸癌試驗中發(fā)揮顯著的生長抑制作用。之前的研究顯示，survivin-siRNA重組腺病毒載體pBAsisurvivin在 SW480細(xì)胞中有顯著的抑制作用，最適濃度為100 nmol/L，但pBAsi-survivin在體內(nèi)的效果還不清楚。本研究希望通過構(gòu)建結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤模型，檢測pBAsi-survivin在體內(nèi)對結(jié)直腸癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 構(gòu)建成功的survivin-siRNA重組腺病毒pBAsi-survivin，腺病毒載體系包含 pBAsi-Hh1、pBAsi-HU6、pBAsi-Mu6，Trizol試劑、第一鏈cDNA合成試劑盒;survivin引物和內(nèi)參GAPDH引物及siRNA模板均購自大連寶生物工程有限公司。BALB/C裸鼠(編號:72915235216)購自南京君科生物科技有限公司，雄性，15只，6周齡，體重16～18 g，SPF級動物，空氣相對濕度40% ～60%，溫度20℃ ～24℃，光照時間12 h/12 h。

SW480細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。培養(yǎng)條件:RPMI1640+10%FBS 培養(yǎng)基 37℃，5%CO2，pH 7.2 ～ 7.4，無菌恒溫培養(yǎng)。

電子天平，游標(biāo)卡尺。低溫高速離心機(jī)(湖南湘立科技儀器有限公司)，核酸電泳儀、電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠);紫外分光光度儀(上海精密儀器有限公司)，PCR儀(Thermo北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司)。凝膠成像系統(tǒng)(Biorad GelDoc XR上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司)，水平搖床(上海喬躍電子有限公司)。PVDF膜，封閉液，洗脫液、脫脂奶粉，一抗、酶標(biāo)二抗，蛋白提取液及相關(guān)抗體購自碧云天生物研究所。酶標(biāo)儀(BIO-RAD上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司);DMSO MTT液96孔板(北京世紀(jì)奧利生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠模型建立及體內(nèi)實驗方案 正常培養(yǎng)的SW480細(xì)胞用胰酶消化，離心，棄上清，沉淀用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，滴度調(diào)整到細(xì)胞懸液1×107/ml，注射到各BALB/C裸鼠右側(cè)腋窩皮下，待腫瘤生長至100 mm3。將裸鼠隨機(jī)分為survivin siRNA腺病毒載體組(A組，5只)、空載體對照組(B組，5只)、空白對照組(C組，5只)，飼養(yǎng)在SPF級屏障系統(tǒng)IVC環(huán)境內(nèi)，稱重標(biāo)號后分別給每組鼠瘤內(nèi)注射(100 nmol/L)pBAsi-survivin、空白載體、生理鹽水 50 μl 1 次，分別在第 1、4、7、10、13、16、19天給藥，1次/d，每天觀察裸鼠的精神、飲食等一般情況，并觀察移植瘤的大體形態(tài)，給藥后第2天測腫瘤的大小并記錄，于接種后第3周末處死，完整剝?nèi)×鰤K并稱重，計算抑瘤率，抑瘤率=(1-實驗組平均瘤重/空白對照組平均瘤重)×100%;腫瘤體積測定(V)=1/2〔腫瘤長徑(L)×腫瘤短徑(S)2〕。

1.2.2 RT-PCR檢測survivin mRNA的變化 取瘤組織約35～50 mg，剪碎、液氮下研磨，按RNA提取試劑盒步驟提取腫瘤組織的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，110 V，30 min。Gelred染色液染色，在紫外分光光度儀下進(jìn)行分析。引物序列:survivin正義:5＇-CAGATTTGAATCGCGGGACCC-3＇，反 義 5＇-CCAGAGTCTGGCTC GTTCTCAG-3＇，產(chǎn)物長度206 bp;內(nèi)參 GAPDH 正義:5＇-GGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3＇，引物序列:5＇-GACCACCTGGTGCTCAGTGT-3＇，產(chǎn)物長度 295 bp，PCR 擴(kuò)增條件:94℃ 30 s，60℃ 30 s，74℃1 min共30個循環(huán)，產(chǎn)物由PCR儀進(jìn)行定量分析〔1〕。

1.2.3 Western印跡檢測survivin蛋白的表達(dá)情況 提取總蛋白，制備濃縮膠和分離膠，將蛋白經(jīng)電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，分別與1∶100稀釋的一抗4℃孵育過夜，TTBS洗膜，1∶200 稀釋的二抗孵育 1.5 h，TTBS洗膜，以β-actin為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光 ，洗片，觀察survivin蛋白表達(dá)強(qiáng)度的變化〔2〕。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件，實驗數(shù)據(jù)均以s表示，組間比較采用t檢驗，多組之間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠皮下移植瘤不同時間點的體積變化及腫瘤抑制率A、B、C三組腫瘤體積在第1、4天變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);在第7、10、13、16、19 天，A 組的腫瘤體積與 B、C 組的體積有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，B組和C組體積變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。隨著時間的延長，與B、C組比較，A組體積增長逐漸減慢，A、B、C組移植瘤重分別為(0.534 2±0.022 3)、(1.296 9±0.031 7)、(1.289 2±0.033 4)g;相對于 C組，A組抑瘤率為58.56%，B組抑瘤率為0.59%。

2.2 RT-PCR檢測survivin mRNA水平的變化 A、B、C組survivin mRNA 相對含量分別為 0.446±0.008、0.714±0.006、0.712±0.002，A組survivin mRNA的相對表達(dá)抑制率為39.4%，明顯高于B組 8.9%和C組8.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。B組和C組survivin mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組裸鼠腫瘤體積隨時間的變化(V/mm3，s，n=5)

表1 各組裸鼠腫瘤體積隨時間的變化(V/mm3，s，n=5)

與A 組比較:1)P＜0.05

組別 1 d 4 d 7 d 10 d 13 d 16 d 19 d A 組 100.32 ±17.54 132.79±19.28 161.35±32.85 189.13±32.54 229.15±43.89 275.53±46.73 317.49±47.81 B 組 98.73±17.14 146.55±36.75 205.13±31.191) 285.97±34.651) 379.11±62.131) 465.25±76.451) 569.39±83.421)C 組 101.35±18.06 153.86±31.32 209.88±22.161) 291.64±38.431) 392.46±62.361) 473.39±77.951) 574.47±84.361)

2.3 Western印跡檢測survivin蛋白的表達(dá) A、B、C組survivin蛋白相對含量分別為 0.401 ±0.008、0.730±0.008、0.734±0.002;A組survivin蛋白的相對表達(dá)抑制率為47.3%，明顯高于B組10.1%和C組9.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。B組和C組survivin mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生是凋亡與增殖失衡的結(jié)果，survivin是目前發(fā)現(xiàn)的分子量最小、作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子。研究表明survivin在人的胚胎、胸腺、甲狀腺、生殖腺、神經(jīng)細(xì)胞、結(jié)腸上皮細(xì)胞等正常組織少量存在，而在結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、皮膚癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中高度表達(dá)〔3〕。survivin在結(jié)直腸癌中的總陽性表達(dá)率為53.2%〔4〕，survivin高度表達(dá)的腫瘤患者生存期明顯縮短〔3，5～7〕。survivin抑制細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條，一種是直接作用于 Caspase，主要通過結(jié)合Caspase-3和Caspase-7抑制二者的活性;survivin也可通過P21間接抑制Caspase活性。另一種是survivin與細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4競爭性結(jié)合，導(dǎo)致CDK2/cyclin-E激活和核糖體(Rb)磷酸化，Rb磷酸化后啟動細(xì)胞進(jìn)入周期，加快G1/S期的轉(zhuǎn)換，使P21從survivin-CDK4復(fù)合物中釋放出來，促使CDK4活化，與線粒體pro-caspase-3結(jié)合，抑制caspase-3活性，阻止線粒體釋放 Cyt-c，抑制細(xì)胞凋亡〔8〕。

RNA干擾技術(shù)(RNAi)是通過雙鏈RNA(dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)與之同源的特異性mRNA表達(dá)受抑制，從而引起基因轉(zhuǎn)錄后水平沉默。研究表明沉默survivin對多種腫瘤的凋亡有明顯的促進(jìn)作用〔9〕。Yan等〔10〕構(gòu)建的腺病毒載體的siRNA用于轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2后，surivivin mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞凋亡增加。Wen等〔11〕用RNAi技術(shù)將用沙門菌質(zhì)粒將survivin基因沉默的同時，將GRIM-19表達(dá)，并轉(zhuǎn)染入喉癌裸鼠移植瘤中，能明顯抑制喉癌細(xì)胞的增殖，抑制率為53.4%。

結(jié)直腸癌目前治療采用以手術(shù)切除為主、放化療為輔的綜合治療，但中晚期結(jié)直腸癌治療效果不理想，亟需尋找其他的治療辦法。沉默survivin不僅能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，還能增加化療藥物的敏感性。鑒于survivin基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)的特性，通過RNAi技術(shù)，可以抑制特定序列基因survivin的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，達(dá)到治療腫瘤的目的。

1 郭玥馨，毛成剛，羅 慶，等.Livin siRNA重組腺病毒的構(gòu)建及其對K562細(xì)胞增殖、凋亡和耐藥的影響〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009;31(14):1353-7.

2 Yoon MJ，Park SS，Kang YJ，et al.Aurora B confers cancer cell resistance to Trail-induced apoptosis via phosphorylation of survivin〔J〕.Carcinogenesis，2012;33(3):492-500.

3 Rosa AC，Nancy BS，Eric M，et al.Antisense inhibition of survivin expression as a cancer therapeutic〔J〕.Mol Cancer Ther，2011;10(2):221-32.

4 Kawasaki H，Altieri DC，Lu CD，et al.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer〔J〕.Cancer Res，1998;58(22):5071-4.

5 Hingorani P，Dickman P，Garcia-Filion P，et al.BIRC5 expression is a poor prognostic marker in Ewing sarcoma〔J〕.Pediatr Blood Cancer，2013;60(1):35-40.

6 Choi J，Chang H.The expression of MAGE and SSX，and correlation of COX2，VEGF，and survivin in colorectal cancer〔J〕.Anticancer，2012;32(4):559-64.

7 Porebska I，Sobańska E，Kosacka M ，et al.Apoptotic regulators:P53 and survivin expression in non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer Genomics Proteomics，2010;7(6):331-5.

8 Suzuki A，Hayashida M，Ito T，et al.Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16 INK4a and Cdk2/cyclin E complex activation〔J〕.Oncogene，2000;19(29):3225-34.

9 Markus P，Ghadim I，Eric D，et al.Survivin is a viable target for the treatment of malignant peripheral nerve sheath tumors〔J〕.Clin Cancer Res，2012;18:2545-57.

10 Yan G，Duan RH，Yin K，et al.Inhibition of survivin expression to induce the apoptosis of hepatocarcinoma cells by adenovirus-mediated siRNA〔J〕.Biosci Trends，2008;2(2):88-93.

11 Wen LJ，Gao LF，Jin CS，et al.Small interfering RNA survivin and GRIM-19 co-expression salmonella plasmid inhibited the growth of laryngeal cancer cells in vitro and in vivo〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2013;6(10):2071-81.