孫 微 蔣維海 劉佳樂 韓 麗 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 3200)

東菱克栓酶(又叫巴曲酶，DF-521)是由巴西蝮蛇毒液中提取的單一成分酶制劑，可以選擇性作用于血纖維蛋白原Aα鍵末端的精氨酸、甘氨酸之間，分解纖維蛋白原為纖維蛋白單體，后單體聚合成多聚體，后者被DF-521分解為纖維蛋白降解產(chǎn)物，同時，其具有分解凝血因子Ⅰ、抑制血栓形成、降低血黏度、增強紅細(xì)胞變形能力、降低血管阻力等作用〔1～3〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的鋅依賴蛋白酶，有研究顯示，腦缺血及再灌注后MMP表達增加，破壞血腦屏障;其中MMP-9與腦缺血再灌注損傷的關(guān)系尤為密切，在缺血早期血腦屏障損害中起著重要作用〔4～6〕。本研究探討腦缺血再灌注損傷后應(yīng)用DF-521的治療作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料 東菱克栓酶注射液(巴曲酶)為北京托畢西藥業(yè)有限公司，一抗為MMP-9兔多抗(武漢博士德生物工程公司)，鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶法(S-P)試劑盒購于北京中山生物技術(shù)有限公司。健康雄性Wistar大鼠，體重250～300 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，合格證號:SCXK-(吉)2007-0003。清潔級動物室飼養(yǎng)，飲水不限，定時喂食。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥 實驗動物按體重隨機分為5組，每組8只，分別為假手術(shù)組、模型組、OF-521高、中、低劑量組(16、8、4 BU/kg)，按常規(guī)進行飼養(yǎng)，進行不同的處理，每天上午灌胃1次，持續(xù)3 d后，建立腦缺血動物模型。假手術(shù)組、模型組每日給予生理鹽水灌胃(10 ml/kg)。

1.2.2 實驗動物模型建立 采用栓線法制備腦缺血再灌注模型。雄性健康Wistar大鼠，末次給予藥物2 h后10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)麻醉。用微動脈夾于右側(cè)頸總動脈近心端夾住，用手術(shù)線于遠心端打一活結(jié)，用栓線通過事先用眼科剪在頸總動脈上剪出的切口進入向頸內(nèi)動脈緩緩?fù)迫爰s18 mm，感到有輕微阻力且標(biāo)記點在動脈分叉處停止，此時說明栓線已達到大腦前動脈。用手術(shù)線結(jié)扎固定栓線，縫合皮膚。假手術(shù)組只分離出頸外動脈以及頸內(nèi)動脈，其他步驟同上，但不進行栓塞〔3〕。待大鼠清醒后，觀察大鼠的體征，出現(xiàn)以下體征者表明模型制作成功:右眼Honer＇s征;左前肢癱瘓，將鼠尾提起，大鼠不能充分伸展左前肢;當(dāng)動物右旋時其左前肢拖在腹下，與右前肢交叉成剪刀狀;當(dāng)右旋時，其左前肢掌面向上，被拖在身體的左側(cè)。48 h后立即斷頭取腦，觀察腦梗死面積，同時進行病理組織學(xué)、免疫組化檢測。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 大鼠腦梗死面積測定 實驗結(jié)束后立即對大鼠進行取腦，于-20℃冰箱放置2 min，便于保持相對固定，便于對腦組織行冠狀切片。將腦組織切成相對均勻的5片，避光于2%三苯基四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)37℃水浴中放置5～10 min，呈蒼白色可判定腦缺血?？蓱?yīng)用BI2000軟件處理系統(tǒng)計算每個腦組織切片損傷面積和總面積，以5個腦組織切片中梗死面積之和與5個腦組織切片面積之和的百分比反映梗死范圍。

1.2.3.2 蘇木素-伊紅(HE)染色 將提取標(biāo)本進行常規(guī)石蠟包埋切片，厚5 μm，HE染色，觀察缺血區(qū)細(xì)胞形態(tài)、大小、染色情況(×200)。

1.2.3.3 MMP-9免疫組化檢測 實驗?zāi)Ｐ统晒?，進行心臟灌注固定，取視交叉前、后2 mm處的腦組織制作切片，腦組織取下后用石蠟包埋，制作厚約5 mm的連續(xù)腦切片。采用S-P染色法進行MMP-9免疫組織化學(xué)染色。細(xì)胞質(zhì)著色呈棕黃色，經(jīng)圖像分析儀每個切片隨機選擇5個視野。采用Image-ProPlus 6.0軟件檢測每張圖片積分光密度(IOD)值。

2 結(jié)果

2.1 各組腦梗死面積比較 與假手術(shù)組(0)相比，模型組的腦梗死面積(0.78±0.13)明顯增大，說明大鼠腦缺血模型建立成功;與模型組比較，DF-521高、中劑量組的腦梗死面積(0.56±0.10、0.66±0.08)顯著減小(P＜0.01，P＜0.05)，其中 DF-521 高劑量組較中劑量組效果更明顯(P＜0.05)。DF-521低劑量組腦梗死面積(0.75±0.11)與模型組比較差異不顯著。

2.2 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組腦區(qū)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常;模型組缺血區(qū)大部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、空泡樣改變，大量淋巴細(xì)胞浸潤;與模型組比較，DF-521高劑量組、中劑量組正常細(xì)胞較模型組明顯增多，僅少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮樣改變，且DF-521高劑量組改善更為明顯。DF-521低劑量組改善不明顯。提示DF-521對大鼠腦缺血再灌注病理學(xué)損傷具有保護作用。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理變化(HE，×200)

2.3 DF-521對 MMP-9的影響 與假手術(shù)組(2 013.5±103.65)比較，模型組 MMP-9表達的 IOD值明顯增高(5 027.38±210.82)(P＜0.01);與模型組比較，DF-521 高、中劑量組 MMP-9表達的 IOD值明顯降低(2 918.80±165.56，3 624.40±196.82)(P ＜ 0.05)，DF-521 低劑量組 (4 928.20±182.42)未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。其中 DF-521 高劑量組、中劑量組及低劑量組MMP-9表達的IOD值兩兩比較具有統(tǒng)計性差異(P＜0.05)。

3 討論

MMPs是一種Zn2+依賴性的蛋白水解酶，與缺血性腦卒中形成、發(fā)展和預(yù)后有很大關(guān)系。MMP-9是MMPs家族的核心成員，主要由血管壁的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成和分泌，具有降解膠原蛋白和彈性蛋白的作用，從而破壞血管壁結(jié)構(gòu)的完整性，并且破壞血腦屏障，導(dǎo)致滲漏和破裂，可引起血管壁基底膜破裂，促進斑塊纖維帽基質(zhì)降解，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，進而形成血栓，最終導(dǎo)致缺血性腦卒中的發(fā)生，甚至有些可能發(fā)生出血性轉(zhuǎn)化〔7〕。在生理情況下，MMP-9以無活性的酶原形式存在，在腦缺血時由于炎癥介質(zhì)的作用，可能激活MMP-9，使其轉(zhuǎn)換為活性成分，MMP-9通過降解Ⅳ、Ⅴ型膠原，破壞ECM和基底膜，破壞血腦屏障的完整性，引起并且加重腦水腫〔8，9〕。有研究表明，給予MMP抑制物可以改善腦缺血再灌注損傷，減輕血管源性腦水腫，減輕腦損傷。本實驗研究結(jié)果顯示，局灶性腦缺血再灌注大鼠給予DF-521后可明顯減小梗死面積，并且隨著劑量的增加，作用越明顯。DF-521是強力降纖酶制劑，主要通過將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為可溶性纖維蛋白原，降低纖維蛋白原的濃度，從而降低血液黏制度，改善血液情況，降低外周血管阻力，增加腦血流量，以達到改善腦組織的供血、抑制血栓形成的作用。通過本實驗研究，認(rèn)為DF-521降低MMP-9的表達可能是其作用機制之一。

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