張曉暄 楊曉春 遠 航 程海濤 王 晶 寶 玲 (一汽總醫(yī)院腎內(nèi)科，吉林 長春 300)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病微血管病變，一旦發(fā)展到終末期腎衰，往往比其他腎臟疾病治療更加棘手〔1〕。Klotho基因是1997年發(fā)現(xiàn)的與衰老發(fā)生密切相關(guān)的功能性基因〔2〕，在人和大鼠的腎臟高表達，并主要定位于腎小管上皮細胞，在維持正常的腎臟生理功能方面發(fā)揮著重要作用。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)注射Klotho基因的糖尿病腎病模型大鼠，其腎臟病理改變有所好轉(zhuǎn)，尿微量白蛋白減少，腎功能指標改善，表明Klotho基因?qū)N具有保護作用，但其機制尚不清楚。本研究擬探討Klotho基因?qū)N腎臟保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 組織RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA marker，寶生物工程(大連)有限公司;免疫組化試劑盒、β-actin抗體，Abgent，美國;Klotho抗體、PAI-1抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司;DMEM，Invitrogen，胎牛血清，Hyclon，美國;含Klotho基因的腺病毒，本課題組制備。

1.2 實驗動物與分組 SPF級健康Wistar雄性大鼠72只，購自吉林大學動物中心，體重200～220 g。實驗室適應性喂養(yǎng)1 w后，取18只大鼠為正常對照組(Con組)，其余54只大鼠禁食 12 h，按照 55 mg/kg體重腹腔注射 STZ〔3〕，72 h 后血糖值≥16.67 mmol/L為糖尿病，2 w后檢測大鼠尿微量白蛋白增高證明DN大鼠模型建立成功。Con組腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。將54只DN大鼠隨機分為DN組(腹腔注射STZ+靜脈注射等體積生理鹽水)、Ad組(腹腔注射STZ+靜脈注射不含Klotho基因的腺病毒)、Klotho組(腹腔注射STZ+靜脈注射含有Klotho基因的腺病毒)，Con組靜脈注射等體積生理鹽水。從糖尿病模型建立成功后第2周開始，Klotho組尾靜脈注射3×108PFU腺病毒，Ad組尾靜脈注射3×108PFU不含Klotho基因的腺病毒，每2 w注射1次〔4〕，DN組和Con組尾靜脈注射等體積生理鹽水。四組均于第4、8、16周處死大鼠。

1.3 免疫組化檢測Klotho、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1蛋白在糖尿病大鼠腎臟的表達 取糖尿病大鼠腎臟，經(jīng)4%多聚甲醛固定、切片，2%BSA封閉后，滴加1∶500稀釋的抗大鼠Klotho、PAI-1抗體，DAB顯色。鏡下觀察 Klotho、PAI-1蛋白在腎小球、腎小管及腎間質(zhì)的表達。以β-actin蛋白作為對照。

1.4 RT-PCR檢測基因mRNA在腎組織的表達情況 取大鼠腎，應用RNA提取試劑盒提取腎臟RNA，RT-PCR擴增Klotho、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、p15、p21、p27、PAI-1、β-actin 基因，引物:Klotho 正義:5＇-TGGCTGAACCAAAAAAACAA-3＇，反義:5＇-GAGCGGTCACTAAGCGAATA-3＇，擴增片段 434 bp;TGFβ1 正義:5＇-ATGGTGGACCGCAACAAC-3＇， 反 義:5＇-GAGCACTGAAGCGAAAGC-3＇，擴 增 片 段 328 bp;p15 正 義:5＇-ATCCCAACGCCGTCAACC-3＇，反義:5＇-TGGCCCTGCTCTTCAGCT-3＇，擴增片段 259 bp;p21 正義:5＇-TACGTCTGGGAGCGTGTTC-3＇，反義:5＇-AAATCTGTTAGGCTGGTCTGC-3，擴增片段 266 bp;p27正義:5＇-AGCTTGCCCGAGTTCTACTA-3＇，反義:5＇-CAGGTCGCTTCCTCATCC-3＇，擴增片段 220 bp;PAI-1 正義:5＇-TACGACATCCTGGAACTGC-3＇，反義:5＇-CACCTCGATCTTGACCTTTT-3＇，擴增片段 324 bp;β-actin 正義:5＇-GGCCACCAACTTCGGAGTAA-3＇，反義:5＇-TGTTCCATGACCCCATGAGC-3＇，擴增片段 210 bp。

PCR 反應條件94℃ 30 s，55℃ ～62℃ 30 s，72℃ 20 s，35 個循環(huán)，72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)照相，Quantity one圖像分析軟件進行灰度分析，以β-actin基因作為對照。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果以s表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測Klotho、PAI-1蛋白在糖尿病大鼠腎臟的表達與分布 與Con組相比，4、8、16 w時，DN組和Ad組大鼠腎小球、腎小管及腎間質(zhì)內(nèi)Klotho蛋白表達量減少，而Klotho組大鼠腎臟Klotho蛋白表達量變化不明顯，與Con組接近(圖1);與 Con組相比，DN組和 Ad組 PAI-1蛋白表達量增加，Klotho組的PAI-1蛋白表達量變化不明顯，接近Con組(圖2)。β-actin蛋白在不同時間各組的表達未見明顯改變(圖3)。

2.2 RT-PCR檢測mRNA在腎組織的表達 瓊脂糖凝膠電泳顯示，Klotho、TGF-β1、p15、p21、p27、PAI-1 基因 PCR 產(chǎn)物與預期擴增產(chǎn)物大小一致。與Con組對比，在4、8、16 w時DN組和Ad組的Klotho mRNA表達量明顯減少，Klotho組Klotho mRNA表達量變化不明顯，但高于DN組和Ad組。DN組和Ad組TGF-β1、p15、p21、p27、PAI-1 mRNA 表達量明顯高于 Con 組，Klotho組變化不明顯，接近Con組，但低于DN組和Ad組。見圖 4，圖 5。

圖1 糖尿病大鼠腎臟Klotho蛋白的表達與分布(×200)

圖2 糖尿病大鼠腎臟PAI-1蛋白的表達與分布(×200)

圖3 糖尿病大鼠腎臟β-actin的表達與分布(×200)

圖4 瓊脂糖凝膠電泳顯示各擴增產(chǎn)物條帶

圖5 第 4、8、16 周糖尿病大鼠腎臟 Klotho、TGF-β1、p15、p21、p27、PAI-1基因mRNA的表達

3 討論

ECM進行性積聚是DN的主要病理表現(xiàn)，也是DN進行性發(fā)展的重要因素，TGF-β1是DN發(fā)生、發(fā)展的重要中介，PAI-1是其引起ECM積聚的環(huán)節(jié)之一。TGF-β1可顯著上調(diào)大鼠系膜細胞PAI-1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達并抑制纖溶酶活性〔5〕。DN腎臟PAI-1表達明顯上升，PAI-1通過與組織型纖溶酶原激活物形成復合體而抑制其活性，抑制ECM的降解，對促進DN時ECM 積聚有至關(guān)重要的作用〔6～8〕。TGF-β1 既可以直接刺激ECM的合成，又可以通過促進PAI-1等蛋白酶抑制物的表達，促進 ECM 的積聚〔9〕。

Klotho基因是新近發(fā)現(xiàn)的獨立的抗衰老基因，通過抑制TGFβ1的信號傳導，可以抑制腎臟纖維化〔10〕。Takeshita等〔11〕研究表明Klotho基因表達下調(diào)可能通過上調(diào)PAI-1 mRNA的表達參與腎臟纖維化的發(fā)生。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)參與了DN發(fā)展的全過程，糖尿病時腎臟局部血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平增加導致血管收縮、腎小球內(nèi)壓力增高、腎小球系膜細胞及內(nèi)皮細胞增生?；钚栽龈叩腁ngⅡ受體通過直接或間接誘導TGF-β1表達，刺激腎臟局部PAI-1的表達，促進腎小管間質(zhì)成纖維細胞的增殖、分化。與本研究相似，有研究同樣利用腺相關(guān)病毒作為載體，將轉(zhuǎn)染Klotho基因到小鼠體內(nèi)改善AngⅡ?qū)е碌哪I臟損傷，轉(zhuǎn)染組的腎功能改善、蛋白尿減少，腎小管、腎間質(zhì)病理學改變減輕〔12〕。新近研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導糖尿病小鼠動物模型中，抗衰老Klotho基因的缺失通過加強TGFβ1和mTOR信號表達，加速了早期DN的進展〔13〕。

本研究結(jié)果顯示在DN大鼠模型的腎臟中，Klotho基因表達降低，TGF-β1、PAI-1的表達增高，經(jīng)Klotho治療后DN腎臟組織的Klotho基因表達增加，同時TGF-β1、PAI-1的表達顯著下降，而無論DN未治療組還是單純腺病毒對照組均未見此種變化，提示Klotho基因可以下調(diào)TGF-β1的表達而減少 PAI-1的表達，緩解ECM積聚，延緩DN進展，從而保護DN大鼠腎臟功能。

DN早期腎臟肥大是其進展的始動因素之一，細胞周期調(diào)控蛋白是控制細胞生長的關(guān)鍵，與DN早期腎臟肥大密切相關(guān)〔14〕。p15、p21、p27是細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子(CDKIs)家族的重要成員，是細胞周期的負調(diào)控因子，其中p15阻止細胞由G1期進入S期，從而抑制細胞的分裂增殖，p21基因可使細胞增殖所需的蛋白質(zhì)磷酸化受阻，在細胞分化和凋亡中p21蛋白的表達增高，p27可阻止細胞通過G1/S期轉(zhuǎn)化的限制點抑制細胞分裂增殖，使細胞周期停滯在G1期和S期的轉(zhuǎn)換，使細胞有機會修復損壞的DNA或修復DNA復制過程中產(chǎn)生的錯誤〔15〕。

本研究表明Klotho基因通過下調(diào)細胞周期負調(diào)控蛋白p15、p21、p27的表達來保護DN大鼠腎臟功能。

綜上所述，Klotho基因能夠下調(diào)糖尿病大鼠腎臟TGF-β1、PAI-1、p15、p21、p27基因的表達，對糖尿病大鼠的腎臟具有保護作用，為臨床上治療糖尿病腎病提供新的干預治療靶點和理論依據(jù)。

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