帕麗丹·吾術(shù)爾 熱依漢·尼沙 (新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830000)

短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)是公認的缺血性腦卒中最重要的獨立危險因素，近期頻繁發(fā)作的TIA是腦梗死的特級警報，4%～8%的完全性腦卒中發(fā)生于TIA之后，其形成機制復雜，多伴有血小板、凝血以及纖溶系統(tǒng)的異?！?〕。血栓前狀態(tài)(PTS)為一種凝血、抗凝及纖溶系統(tǒng)失調(diào)的病理過程，具有導致血栓形成的多種血液學變化。本研究對96例TIA患者PTS分子標志物進行檢測，探討PTS分子標志物在TIA患者中的變化及其意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2009年9月至2011年2月在新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的96例TIA患者，男52例，女44例，平均年齡(61.34±11.34)歲。診斷符合1995年第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標準〔2〕，并經(jīng)頭顱CT和(或)頭顱磁共振成像(MRI)證實，排除了腦出血等其他腦血管疾患，發(fā)病前患者未曾服用過抗血小板聚集及抗凝藥物，其中頸內(nèi)動脈(ICA)系統(tǒng)TIA 35例，椎-基底動脈系統(tǒng)TIA 61例。健康對照組為我院健康查體者39例，男16例，女23例，平均年齡(59.42±10.65)歲，無高血壓、糖尿病、心臟病等心腦血管疾病，且肝腎功能正常者。

1.2 血小板膜糖蛋白(CD62P)的檢測 清晨采肘靜脈血，全血由 EDTA 抗凝。各管加稀釋液 70 μl，注入全血 5 μl，加入CD62P-FITC(法國 IMMUNOTECH公司)8 μl進行染色，輕搖混勻，避光孵育30 min，用PBS調(diào)整血小板濃度為1×106/μl，待測。打開流式細胞儀(EpicsXL-型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司)選擇氬離子激光激發(fā)，激發(fā)濃度為488 nm，測定中以前向角散射(FSC)、對側(cè)向散射(SSC)，調(diào)整電壓，圈出血小板群，獲取20 000個血小板黃光信號(FITC、PE)，用PMT2、PMT3收集，轉(zhuǎn)化成log信號直方圖，以Expo軟件進行處理，得出CD62P的陽性血小板百分數(shù)。

1.3 凝血4項指標的檢測 包括活化部分凝血活酶時間(PT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶時間(TT)及血漿凝血酶原時間(APTT)。取清晨空腹靜脈血2 μl，置于檸檬酸鈉抗凝真空管，3 000 r/min，離心15 min，然后由血凝分析儀(AMAX-200型全自動血凝分析儀，德國Amelung公司)檢測，使用FIB凝血酶、FIB定值血漿、FIB緩沖液等配套試劑(上海太陽生物技術(shù)有限公司)，采用CLAUSS比濁法。

1.4 組織性纖溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI-1)的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法:采用96孔板的包被抗人t-PA抗體和PAI抗體的反應板(上海太陽生物技術(shù)有限公司)，將2 ml全血離心后取血漿;將待測血漿40 μl分別加入包被抗人t-PA抗體和PAI抗體的反應條內(nèi)，充分混勻，37℃孵育150 min;洗板機(Sunrise Remote洗板機，丹麥Sunrise公司)洗滌;顯色:每孔加OPD底物稀釋液(上海太陽生物技術(shù)有限公司)100 μl，37℃孵育15～20 min;終止:每孔加終止液(上海西唐生物技術(shù)有限公司)50 μl;比色:在酶標儀(Sunrise Remote酶標儀，丹麥Sunrise公司)上492 nm處測定各孔的OD值。

1.5 內(nèi)皮素(ET)的檢測 取圓底聚苯乙烯試管若干，用微量加樣器加樣:血漿、125I-ET(紅色)(北京北方生物技術(shù)研究所)、兔抗-ET抗血清(藍色)(北京北方生物技術(shù)研究所)各100 μl，搖勻，4～8℃溫育18～24 h。每管加入驢抗兔免疫分離劑(北京北方生物技術(shù)研究所)500 μl，充分搖勻，室溫放置15 min，使用低速冷凍離心機(KDC-2046型低速冷凍離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)3 500 r/min離心15 min，吸棄上清待測，使用放射免疫計數(shù)器(GC-2016γ型放射免疫計數(shù)器，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)測各沉淀管的放射性計數(shù)(cpm)。數(shù)據(jù)處理:使用logit-log處理軟件由電腦自動處理得出結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

與健康對照組相比，TIA組血小板表面CD62P的表達、血漿PAI-1水平均升高(P＜0.05);血漿 t-PA水平下降(P＜0.05)，見表1。與健康對照組相比，TIA組血漿FIB水平升高(P＜0.05);APTT縮短(P＜0.05);而 PT和 TT無差異(P＞0.05)，見表2。

表1 兩組CD62P、t-PA、PAI-1測定結(jié)果(s)

表1 兩組CD62P、t-PA、PAI-1測定結(jié)果(s)

與健康對照組比較:1)P＜0.05，下表同

組別 n CD62P(%)t-PA(ng/L)PAI-1(ng/L)TIA 組 96 4.45±2.811)15.25±10.101)52.63±14.161)健康對照組 39 2.29±1.58 22.33±7.39 47.49±12.80

表2 兩組APTT、PT、TT及FIB結(jié)果(s)

表2 兩組APTT、PT、TT及FIB結(jié)果(s)

組別 n APTT(s)PT(s)TT(s)FIB(mg/L)TIA 組 96 31.06±7.111)14.88±2.40 15.07±2.30 3.63±1.241)健康對照組 39 36.12±8.21 14.35±2.59 16.74±18.56 2.63±0.53

3 討論

血栓前狀態(tài)是指機體的促凝和天然抗凝機制平衡失調(diào)，血管內(nèi)皮細胞、血小板、凝血、纖溶系統(tǒng)等發(fā)生改變所引起有利于血栓形成的病理狀態(tài)〔3〕，其變化可以反映血管內(nèi)皮細胞受損或受刺激;血小板和白細胞被激活或功能亢進;凝血蛋白含量增高或被激活;抗凝蛋白的含量減少或結(jié)構(gòu)異常;纖溶因子含量減低或活性減弱;血液黏度增高和血流減慢等一系列病理變化。

CD62P是目前所知反映血小板活化與釋放最特異的標志物〔4〕，其作用是介導血小板黏附于內(nèi)皮細胞，以及血小板中性粒細胞與血小板單核細胞的連接，使中性粒細胞激活，釋放多種活性酶、細胞因子等血管活性物質(zhì)，損傷內(nèi)皮細胞，引起基底膜通透性增加、細胞外基質(zhì)增生、纖溶活性下降、纖維蛋白原沉積等多種生物學效應，啟動血栓形成過程。本研究結(jié)果提示TIA患者本身即存在血小板活化的情況，并可能加速其血栓形成的進展，故檢測血小板膜上CD62P，可以了解血小板活化程度，并可作為TIA患者病情監(jiān)測的有效指標。

PT、FIB、TT、APTT是反映凝血功能狀況的4個指標。其中PT是一種反映外源性凝血系統(tǒng)有無異常的較敏感篩選試驗;TT是觀察凝血因子血中抗凝物質(zhì)增多與否;APTT是內(nèi)源凝血系統(tǒng)較為敏感和常用的篩選試驗;FIB是重要的凝血因子，是凝血系統(tǒng)中的“中心”蛋白質(zhì)，是血漿中重要的凝血因子，可誘導血小板聚集，刺激因子相關(guān)抗原(vWF)釋放，后者在調(diào)節(jié)血小板黏附于受損的血管壁過程中起關(guān)鍵作用。FIB同時是參與血小板黏集的重要輔助因子，在激活的血小板之間作為橋梁與血小板膜上的糖蛋白受體(GPⅡb/Ⅲa)結(jié)合，將它們互相連接起來，從而促進血小板黏集和血栓形成〔5〕。本研究提示TIA患者體內(nèi)存在血液凝固性增強傾向。有報道FIB與局灶性腦血管病以及周圍血栓性疾病的嚴重程度有很強的相關(guān)性〔6，7〕。血栓前狀態(tài)時，PT、APTT可能縮短，F(xiàn)IB水平增高，故可以將 PT、APTT以及FIB作為血栓前狀態(tài)的初步篩選指標〔8，9〕。因此，對于TIA患者，應常規(guī)檢測PT、APTT以及FIB等凝血指標，以便充分了解血液的凝血狀態(tài)以及判斷血栓前狀態(tài)的程度。

t-PA是纖溶系統(tǒng)的主要啟動因子，它能選擇性激活血栓中纖維蛋白原表面的纖溶酶原生成纖溶酶，水解纖維蛋白，是體內(nèi)最強烈的纖溶酶原激活物。PAI-1的主要功能是以1∶1的比例與t-PA活性中心的絲氨酸發(fā)生不可逆的共價結(jié)合，形成復合物，這種復合物具有穩(wěn)定性、不可逆性，從而抑制t-PA的活性〔10〕。t-PA過高和(或)PAI-1降低，致纖溶活性亢進，可以導致出血癥狀;t-PA過低和/或PAI-1增高，致纖溶活性降低，可以導致血栓形成。t-PA可清除正常血液循環(huán)中纖維蛋白，內(nèi)皮釋放的t-PA約95%被過量的PAI快速結(jié)合失去活性。t-PA降低，提示纖溶活力降低，是由血管內(nèi)皮細胞功能紊亂所致。PAI升高主要是動脈粥樣硬化引起血管內(nèi)皮損傷導致t-PA合成能力降低，血管內(nèi)膜下層平滑肌細胞增殖并向內(nèi)膜移行合成PAI增多。所以，t-PA、PAI-1的檢測臨床常用于纖溶及纖溶抑制功能、內(nèi)皮細胞功能以及血栓前狀態(tài)的判斷〔11〕。本文結(jié)果表明臨床上采取抗凝治療對于動脈硬化性斑塊形成的低動力性TIA或深穿支性TIA以及栓塞性TIA是積極和有益的，因纖溶活性的降低，給予降纖酶治療可能有助于提高纖溶活性，防止血栓的形成和進展，進而防止TIA的發(fā)生。

本研究提示早期和長期使用抗血小板及改善內(nèi)皮功能的藥物，可能對預防腦缺血性事件的發(fā)生和發(fā)展具有重要臨床意義。另外，在臨床處理TIA時，應兼顧抗血小板及抗凝治療。

1 俞 龍，徐 耀，吳 健，等.短暫性腦缺血發(fā)作與血栓前體蛋白及纖維蛋白原的關(guān)系〔J〕.臨床神經(jīng)病學雜志，2005;18(6):411-3.

2 中華醫(yī)學會神經(jīng)科分會.各類腦血管疾病診斷要點〔J〕.中華神經(jīng)科雜志，1996;29(6):379-81.

3 Bauer KA，Rosenberg RD.The pathophysiology of the prethrombotic state in humans:insights gained from stadies using markers of hemostatic system activation〔J〕.Blood，1987;70(2):343-6.

4 Haissan AS，Daniel Y，Jean F，et al.Endothelial progenitor cells bind and inhibit platelet function and thrombus formation〔J〕.Circulation，2009;120(22):2230-9.

5 Stephan P，Christoph G，Veronika S，et al.Plasma fibrinogen levels and porgonosis in patients with ovarian cancer:a multicenter study〔J〕.Oncologist，2009;14(10):979-85.

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9 鄧家棟，楊崇禮，楊天楹，等.臨床血液學〔M〕.上海:上?？茖W技術(shù)出版社，2001:1-113.

10 Kurt B，Jan-Hakan J，Torbjorn N，et al.Effects of carvedilol or metoprolol on PAI-1，tPA-mass concentration or von willebrand factor in chronic heart failure-a COMET substudy〔J〕.Thrombosis Res，2010;125(2):46-50.

11 With Noto AT，Bogeberg Mathiesen E，Amiral J，et al.Endothelial dysfunction and systemic inflammation in persons with echolucent carotid plaques〔J〕.Thromb Haemost，2006;96(1):53-9.