熊 偉 吳煌福 黃光越 陳華敏 吳曉明 (海南省農墾總醫(yī)院腫瘤外科，海南 ?？?430000)

乳腺癌是一種異質性疾病，其發(fā)生發(fā)展過程中涉及多基因的異常改變，而篩選鑒定與其發(fā)病關系密切的基因有助于提高老年乳腺癌的治療效果。氧化應激和上皮間質轉化均參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，介導了腫瘤信號傳導和細胞代謝過程〔1，2〕。過氧化物氧化還原蛋白1(Prdx1)是一種抗氧化蛋白，具有過氧化氫酶活性，可調節(jié)機體氧化應激水平〔3〕，而Snail蛋白可調節(jié)多種腫瘤細胞的上皮間質轉化〔4〕，目前尚無關于Prdx1和Snail蛋白在老年乳腺癌表達的報道。本研究擬通過檢測老年乳腺癌組織中Prdx1和Snail的表達情況，分析兩者與臨床病理特征的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇本院行手術切除并經病理學確診的85例老年乳腺癌患者，根據國際抗癌協(xié)會TNM分期方案進行臨床分期:Ⅰ期26例，Ⅱ期28例，Ⅲ期20例，Ⅳ期11例;組織學分級:Ⅰ期23例，Ⅱ期27例，Ⅲ期28例;腫瘤直徑:≤2 cm者53例，＞2 cm者32例;絕經者42例，有淋巴結轉移者47例，ER陽性者49例，PR陽性者47例，HER-2陽性者51例。收集以上患者中51例癌旁組織。納入標準:(1)均為老年初治乳腺癌患者;(2)術前均未行放化療及內分泌治療;(3)無長期服用激素史，近3個月內未使用雌激素類藥物;(4)一般資料完整且真實;(5)本研究獲本院倫理委員會批準。所有病理組織均于離體30 min內取材，根據研究需要切取大小適中的組織塊置于凍存管內編號并于液氮內保存，癌旁組織距手術切緣2 cm以上。

1.2 主要試劑與儀器 兔抗人Prdx1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司產品，鼠抗人Snail多克隆抗體購自美國Signalway公司，PV6000通用型二步法免疫組化試劑盒購自北京中山生物工程公司，DAB顯色液購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。光學顯微鏡購自Olympus公司，生物組織攤片機、生物組織烤片機金華市益迪醫(yī)療設備廠，石蠟切片機購自德國LEICA公司。

1.3 免疫組化主要步驟 將病理組織進行石蠟包埋，低溫冰箱復溫，制備病理切片(厚約5 μm)，根據常規(guī)免疫組化步驟依次進行脫蠟、酒精水化、檸檬酸鹽酸緩沖液高壓修復、內源性過氧化物酶滅活后，分別加入兔抗人Prdx1多克隆抗體及鼠抗人Snail多克隆抗體(工作液稀釋度均為1∶50)，37℃孵育30 min，DAB顯色、蘇木素復染、梯度酒精脫水及二甲苯透明處理后，采用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。分別以PBS代替一抗及已知陽性胃癌組織切片作陰性對照和陽性對照。

1.4 免疫組化的結果判斷標準 Prdx1和Snail的陽性表達均定位于胞質，呈棕黃色或棕黃色。所有切片均由2名經驗豐富的病理醫(yī)生在光鏡下采用雙盲法閱片，并根據陽性細胞數及染色情況判斷表達情況:(1)按陽性細胞數計數:陽性細胞數≤5%計為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;(2)按染色深淺:無陽性細胞計為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以兩者乘積＜5分為低表達，≥5分為高表達。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件，計數資料采用χ2檢驗，采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 乳腺癌中Prdx1和SphK1蛋白的表達情況 老年乳腺癌組織中Prdx1和Snail的高表達率分別為69.4%(59/85)和75.3%(64/85)，均高于癌旁組織的31.4%(16/51)和43.1%(22/51)(χ2=18.647，14.178，P＜0.05)，見圖 1。

圖1 Prdx1、Snail在乳腺癌組織及癌旁組織的表達情況(PV6000，×100)

2.2 老年乳腺癌組織中Prdx1蛋白表達與臨床病理參數的關系 Prdx1蛋白表達與組織學分級、病理類型和腫瘤大小均無關，但與分期、淋巴結轉移、ER、PR及 HER-2表達有關(P＜0.05)。見表1。

2.3 老年乳腺癌組織中Snail蛋白表達與臨床病理參數的關系Snail蛋白表達與乳腺癌分期、腫瘤大小、病理類型、淋巴結轉移、ER及PR表達均無關，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但與組織學分級及HER-2表達有關，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.4 老年乳腺癌組織中Prdx1和Snail蛋白表達的相關性 老年乳腺癌組織中Prdx1與Snail蛋白的表達呈正相關(r=0.571，P=0.016)，見表 2。

表1 Prdx1和Snail蛋白表達與乳腺癌臨床病理參數的關系〔n(%)〕

表2 乳腺癌組織中Prdx1和Snail蛋白表達的相關性〔n(%)〕

3 討論

氧化應激是腫瘤發(fā)生的主要機制之一，如活性氧(ROS)參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號轉導通路和能量代謝〔5，6〕。ROS在體內可降低甚至破壞大分子物質的穩(wěn)定性，如脂質、蛋白質和核酸過氧化等，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展;而抗氧化劑可清除ROS，在一定程度上保護了正常細胞。Prdx1具有抗氧化作用，可清除ROS、調節(jié)細胞H2O2并參與氧化相關信號通路的調節(jié)〔7〕。目前研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在腫瘤調控中具有雙重作用，既可阻斷ROS引起的細胞惡性轉化，又可降低ROS誘導的腫瘤細胞凋亡(即促使腫瘤細胞存活的作用)。Prdx1在肺癌、結直腸癌及舌鱗癌組織中均上調〔8〕，且表達與腫瘤復發(fā)及預后較差有關。故推測Prdx1的表達上調參與了惡性腫瘤的發(fā)生并促進其進展。

上皮間質轉化是一種基本生理現(xiàn)象，不僅參與胚胎發(fā)育過程中的器官形成，而且參與了惡性腫瘤的侵襲轉移。Snail可通過促進E-鈣黏蛋白表達誘導上皮間質轉化，繼而增加了腫瘤細胞侵襲性〔9〕。另有研究指出，Snail還可通過抑制免疫過程來加速腫瘤細胞轉移及浸潤〔10〕。氧化應激及上皮間質轉化在腫瘤惡化進程中發(fā)揮重要作用，而Prdx1和Snail在兩種機制中發(fā)揮重要作用，但在老年乳腺癌尚無報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，老年乳腺癌中Prdx1和Snail呈高表達，提示兩者過表達可能在老年乳腺癌發(fā)病及病情惡化中起作用;Prdx1蛋白表達與疾病分期、淋巴結轉移及性激素表達水平有關，且惡性程度越高，該蛋白的陽性表達率越高;Snail蛋白與乳腺癌的惡性程度有關，而盡管兩種蛋白調控的機制不同，可能存在一定的交互作用，可能作為乳腺癌治療的靶點。

1 張松峰，田 華，潘立新，等.老年乳腺癌患者復發(fā)類型及其危險因素〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(19):4722-4.

2 王麗娟，張穎超，徐景偉，等.老年和青年乳腺癌的分子分型與淋巴結轉移的對比〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(15):3771-2.

3 Zhang B，Wang Y，Su Y.Peroxiredoxins，a novel target in cancer radiotherapy〔J〕.Cancer Lett，2009;286(2):154-60.

4 郭 凱，王曉東.肺癌組織中EMT相關蛋白的表達變化及意義〔J〕.山東醫(yī)藥，2012;52(2):70-1.

5 Neumann CA，Cao J，Manevich Y.Peroxiredoxin 1 and its role in cell signaling〔J〕.Cell Cycle，2009;8(24):4072-8.

6 成薇婷，胡作為，田德英，等.Hedgehog信號通路與Snail在肝癌細胞系中的表達及意義〔J〕.華中科技大學學報(醫(yī)學版)，2010;39(2):212-5.

7 Robinson MW，Hutchinson AT，Dalton JP，et al.Peroxiredoxin:a central player in immune modulation〔J〕.Parasite Immunol，2010;32(5):305-13.

8 Neumann CA，F(xiàn)ang Q.Are peroxiredoxins tumor suppressors〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2007;7(4):375-80.

9 張墨，宋永勝，卜仁戈等.膀胱尿路上皮癌組織中Snail蛋白表達與E-cadherin蛋白、T細胞亞群的相關性分析〔J〕.中華泌尿外科雜志，2011，32(9):631-5.

10 吳繼鋒，馬 偉，張 紅，等.Snail基因及其蛋白、E-cadherin蛋白在胃癌中的表達及其臨床意義〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志，2009;18(2):167-73.