張增雷 宋秋穎 胡 靜 張 偉 潘艷明 任鳳云

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

在眾多影響肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度決定了患者預(yù)后和治療手段的選擇。近來，由于淋巴管的特異性標(biāo)志物如 LYVE-1，prox-1，podoplanin和D2-40等的發(fā)現(xiàn)，使研究腫瘤新生淋巴管的臨床和病理學(xué)意義成為可能，也使研究腫瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移逐漸成為研究熱點。本實驗通過檢測非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-C的表達情況及微淋巴管密度(LMVD)，擬揭示VEGF-C的表達及LMVD與包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在內(nèi)的病理學(xué)參數(shù)間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 來自2007年9月至2008年6月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院和附屬第三醫(yī)院確診為NSCLC患者的手術(shù)切除組織，其中腺癌58例，鱗狀細(xì)胞癌38例。樣本取自手術(shù)切除的肺葉組織，標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，其中60例新鮮組織置于液氮中速凍，儲存于－80℃低溫冰箱中直至RNA抽提。兔抗人VEGF-D多克隆抗體和鼠抗人D2-40單克隆抗體購自Santa Cruz公司。PV-9000免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實時定量RT-PCR(QRT-PCR)檢測試劑均購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判定 參照PV9000兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片，光鏡觀察。PBS代替一抗作陰性對照。以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，以每張切片中看到＞30%的腫瘤細(xì)胞質(zhì)染色陽性判定為VEGF-C陽性。在低倍鏡下，選取D2-40陽性脈管最豐富的區(qū)域，在200倍視野范圍計算5個視野的淋巴管數(shù)目，取其平均值作為LMVD。

1.3 QRT-PCR

1.3.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 將肺癌組織從液氮中取出，研磨成粉末，轉(zhuǎn)入DEPC水處理過的1.5 ml EP管中，按比例加入總RNA提取液RNAiso reagent(TaKaRa Code.D312，大連)，按操作說明書提取肺癌組織總RNA，－70℃保存待用。取適量稀釋后測定A260和A280的吸光度比值，計算RNA濃度。另取5 μl RNA溶液用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察RNA的完整性。取總 RNA 1 μg，以 Oligo dT和 Random 6 mers(TaKaRa，大連)為引物，使用 Prime ScriptTM RT-PCR Kit(TaKaRa Code.DRR014A，大連)進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照操作說明進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物－20℃保存待用。

1.3.2 引物設(shè)計與合成 在GenBank上查找人VEGF-C基因的mRNA序列，取其保守區(qū)，使用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，以GAPDH為內(nèi)參，引物由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司合成。VEGF-C基因的引物序列:正義5'-CCGTGAAAATGCTGAAAGAGG-3'，反義5'-GTTGCCGATGTGAATGAGGA-3';GAPDH基因的引物序列:正義5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反義 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。隨機取兩樣本的cDNA作為模板，應(yīng)用Thermal Cycler DiceTM Real time system(TaKaRa，大連)進行Real Time PCR擴增，分析擴增曲線和融解曲線，鑒定引物的特異性。

1.3.3 VEGF-C mRNA的熒光定量PCR檢測 RT反應(yīng)體系:5×Prime ScriptTM 緩沖液 2 μl，Prime ScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5 μl，Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μl ，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μl，總 RNA 2 μl，RNase Free dH2O 4.5 μl，反應(yīng)條件為:37℃ 15 min 85℃ 5 s，PCR反應(yīng)體系為:SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5 μl，上下游引物(各 10 μmol/L)0.5 μl、RT 產(chǎn)物 2 μl、dH2O 10 μl至 25 μl。反應(yīng)條件為:95℃ 預(yù)變性10 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個循環(huán)。以目的基因 VEGF-C與內(nèi)參照(GAPDH)的比值表示目的基因的相對含量。每個樣本重復(fù)3次，以均值表示結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C免疫組化染色結(jié)果 在免疫組化染色中，VEGFC的染色具有不均勻性，癌侵犯邊緣區(qū)域染色與癌中心區(qū)域差異明顯，尤其以中晚期的腫瘤表現(xiàn)更為明顯。VEGF-C染色的陽性部位位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒。癌中央?yún)^(qū)，VEGF-C陽性反應(yīng)可見于腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)的巨噬細(xì)胞，癌侵犯邊緣區(qū)VEGF-C陽性反應(yīng)亦可見于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，見圖1。癌侵犯邊緣部位VEGF-C的陽性表達率〔57例(59.41%)〕明顯高于癌中央部位的陽性表達率〔42例(43.8%)〕(P=0.030)。

圖1 NSCLC組織VEGF-C表達(×200)

2.2 VEGF-C蛋白表達與臨床病理資料的相關(guān)性 在癌侵犯邊緣區(qū)，VEGF-C高表達組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生明顯高于低表達組(P=0.014)，在癌中央?yún)^(qū)卻未發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性。見表1。

表1 NSCLC組織VEGF-C表達與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性〔n(%)〕

2.3 VEGF-C mRNA在NSCLC組織的表達 癌中央組織VEGF-C基因的表達量(0.352±0.263)明顯低于癌邊緣組織(0.957±0.451)和癌周圍肺組織(0.856±0.339)(P＜0.001)，但VEGF-C mRNA的表達量在癌邊緣組織與癌周肺組織之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.170)。對于邊緣部位，VEGF-C的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P=0.023)。見表2。

表2 NSCLC組織VEGF-C mRNA表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(s)

表2 NSCLC組織VEGF-C mRNA表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(s)

病理因素 n 癌邊緣 P值 癌中央 P值類型 腺癌 39 1.033±0.445 0.076 0.397±0.281 0.067鱗癌 21 0.816±0.437 0.267±0.206分化 高分化 17 0.882±0.400 0.422 0.324±0.219 0.605中、低分化 43 0.987±0.470 0.363±0.280 TNM分期ⅠA/ⅠB 30 0.922±0.475 0.787 0.326±0.247 0.707ⅡA/ⅡB 12 0.956±0.460 0.398±0.369ⅢA 18 1.016±0.420 0.364±0.213淋巴管侵犯 陰性 34 0.931±0.468 0.610 0.334±0.243 0.549陽性 26 0.991±0.434 0.375±0.291淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性 36 0.850±0.412 0.023 0.336±0.236 0.575陽性 24 1.118±0.467 0.375±0.303

2.4 VEGF-C與LMVD的相關(guān)性 D2-40特異染色管腔不規(guī)則的淋巴管(圖2A)。D2-40陽性淋巴管在腫瘤組織分布不均勻，癌中央淋巴管大多管腔較小，由于腫瘤細(xì)胞的浸潤，多數(shù)管腔不完整而充填入腫瘤組織或管腔處于塌陷狀態(tài)(圖2B)。癌侵犯邊緣淋巴管大多管腔處于擴張狀態(tài)，且腔內(nèi)可見浸潤轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞(圖2C)。

腫瘤組織中，癌邊緣部位 LMVD明顯高于癌中央?yún)^(qū)(19.01±7.55 vs 15.15±5.72，P＜0.001)。有淋巴管侵犯的腫瘤組癌邊緣LMVD明顯高于無淋巴組(21.37±7.93 vs 17.48±6.27，P=0.009)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組癌邊緣LMVD明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(21.28±7.89 vs 17.81±6.90，P=0.024)。

LMVD高于平均密度的腫瘤組定義為高淋巴管密度組，反之定義為低淋巴管密度組。在癌侵犯邊緣區(qū)，高淋巴管密度組VEGF-C表達明顯高于低淋巴管密度組(P＜0.005，圖3A);而在癌中央?yún)^(qū)，這種相關(guān)性雖未達到統(tǒng)計學(xué)意義，但高淋巴管密度組較低淋巴管密度組仍有相對較高的VEGF-C mRNA表達(P=0.102，圖3B)。

圖2 D2-40特異染色檢測LMVD(×200)

圖3 癌侵犯邊緣淋巴管密度及癌中央LMVD與VEGF-C mRNA表達的關(guān)系

3 討論

大部分惡性腫瘤(尤其是上皮來源的惡性腫瘤)早期以淋巴道轉(zhuǎn)移為主，因此，區(qū)域引流淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況是評估預(yù)后和制定治療策略的重要生物學(xué)指標(biāo)。近年來，由于淋巴管特異性標(biāo)記物及淋巴管生成因子的發(fā)現(xiàn)，使越來越多的人開始進行惡性腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移研究。

NSCLC在腫瘤早期即可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。以往關(guān)于NSCLC淋巴管生成的研究多見于VEGF-C和其受體VEGFR-3的研究。然而，對于VEGF-C影響NSCLC預(yù)后這一問題上結(jié)論不一致〔1～4〕。本研究顯示，VEGF-C的表達在癌侵犯邊緣高于癌中央?yún)^(qū)。在癌中央?yún)^(qū)，VEGF-C的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間未見相關(guān)性，然而在癌組織的侵犯邊緣，VEGF-C的表達與腫瘤的淋巴管侵犯或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。在癌組織侵犯的邊緣區(qū)，VEGF-C高表達的腫瘤組其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯高于低表達組的發(fā)生率，而且淋巴管侵犯的發(fā)生率亦明顯增高。

對于NSCLC而言，Kajita等〔2〕應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法報道VEGF-C表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生明顯相關(guān)，Arinaga等〔3〕報道沒有明顯的相關(guān)性。本研究結(jié)果提示，應(yīng)用免疫組化和PCR研究，研究結(jié)果是否一致很可能取決于所檢測的部位。雖然QRT-PCR檢測顯示的VEGF-C mRNA表達不僅僅來源于腫瘤細(xì)胞，還有間質(zhì)細(xì)胞等陽性部位，但是癌侵犯邊緣VEGF-C的同時高表達且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管侵犯的相關(guān)性提示我們，VEGF-C的高表達有利于腫瘤淋巴管生成和腫瘤細(xì)胞的淋巴管轉(zhuǎn)移，提示對VEGF家族整體的研究也許比在實驗條件下單獨研究其中某一因子更為重要，這也許正是多年來這方面動物實驗研究與臨床實驗研究始終存在分歧的原因所在。

D2-40為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其免疫組化染色可以檢測淋巴管和腫瘤細(xì)胞的淋巴管侵犯〔5，6〕。而且，腫瘤侵犯邊緣的高淋巴管密度有可能決定了腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移〔7〕。本實驗顯示，大部分D2-40陽性管腔位于腫瘤的邊緣，而且癌周淋巴管密度明顯高于癌內(nèi)淋巴管密度，與癌周低淋巴管密度組相比，癌周的高淋巴管密度組VEGF-C mRNA表達也明顯高于癌周低淋巴管密度組，而且癌周的高淋巴管密度組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管侵犯的發(fā)生率亦明顯增高。

綜上，NSCLC組織VEGF-C的表達可能調(diào)控著腫瘤的淋巴管生成，癌侵犯邊緣VEGF-C的高表達可能與淋巴管的生成和腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究也說明，VEGF-C在NSCLC組織組織不同部位的表達有明顯的差異，對癌組織的不同部位進行有選擇的VEGF-C表達檢測，會更加有利于評估患者的淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況。

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