高冬梅 李小文 張媛媛 朱明玥 馬斌林

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科，新疆 烏魯木齊 830011)

人乳頭瘤病毒(HPV)，特別是高危型病毒的感染在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用〔1〕。microRNA(miRNA)是一類單鏈非編碼小分子RNA，在真核細(xì)胞中廣泛分布，可通過與靶基因的信使RNA的3'UTR端堿基相對(duì)或完全配對(duì)，導(dǎo)致靶基因的翻譯受到抑制，或者可以促進(jìn)靶基因的降解，因此可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)〔2〕。miRNA-21的編碼基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因(VMP1)編碼區(qū)，VMP1基因的第十內(nèi)含子〔3〕。miRNA-21在人類多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，例如乳腺癌、胃癌、肺癌等〔4～6〕。17q23.2同樣是HPV容易發(fā)生整合的區(qū)域〔7〕。HPV感染與女性宮頸癌的發(fā)生有密切聯(lián)系，是否由于HPV的整合而導(dǎo)致miRNA-21在該腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高還有待于進(jìn)一步研究。本研究分析miRNA-21與高危型HPV感染之間的關(guān)系，探討其在子宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變以及宮頸鱗狀細(xì)胞癌(ICC)發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象 收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2009年6月至2013年12月維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細(xì)胞癌，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ和Ⅱ級(jí)、CINⅢ級(jí)石蠟標(biāo)本各20例，所有患者均未接受過放療、化療或者其他化學(xué)及物理治療。患者年齡29～70歲，平均46.5歲。

1.2 試劑 HPV16型探針(Y1407)和通用型檢測(cè)試劑盒(K0601)均來(lái)自美國(guó)Dako公司。TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，miRNA-21RT 引物、miRNA-21 Real time、U6 RT 引物、U6 Real time、2× PCR TaqMan Universal PCR ，TaqMan MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 原位雜交法 3 μm厚石蠟組織切片脫蠟2次，無(wú)水乙醇2次，蛋白酶K消化。HPV16探針于載玻片上，加蓋玻片，加熱90℃ 5 min;42℃ 20 min，37℃過夜雜交;1×SSC和TBS2各沖洗3次;加檢測(cè)試劑，孵育37℃ 20 min，TBS3沖洗3次;反應(yīng)物孵育1 h水洗，核固紅復(fù)染，脫水，封片觀察。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-21 細(xì)胞總RNA采用Trizol一步法提取，RNA經(jīng)異丙醇法濃縮，總RNA的純度由分光光度計(jì)測(cè)定，總RNA的質(zhì)量經(jīng)甲醛變性凝膠電泳質(zhì)檢。根據(jù)試劑說(shuō)明書操作，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA:反應(yīng)條件:16℃ 30 min，42℃ 30min，85℃ 5 min。然后按 2×PCR TaqMan Universal PCR試劑盒說(shuō)明書操作，應(yīng)用U6 snRNA作為內(nèi)對(duì)照。分別以miRNA-21和U6第一鏈為模板，用miRNA-21和U6 snRNA熒光探針為引物擴(kuò)增以上熒光PCR。所有的檢測(cè)均應(yīng)用PRISM 7500型(Applied Biosystems，USA)熒光定量PCR儀進(jìn)行測(cè)量，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，應(yīng)用相對(duì)定量分析法2-△△CT進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS19.0軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HPV16在ICC CIN I和Ⅱ，CINⅢ級(jí)組織中的表達(dá)差異ICC組織中HPV16陽(yáng)性率為75%(15/20);CINⅢ級(jí)HPV16陽(yáng)性率為55%(11/20);CINⅠ和Ⅱ級(jí)組織中 HPV16陽(yáng)性率為20%(4/20)。CINⅠ和Ⅱ級(jí)與CINⅢ級(jí)、ICC組比較差異顯著(P=0.024)，CINⅢ級(jí)與ICC組無(wú)顯著性差異(P=0.160)。

2.2 miRNA-21在ICC，CINⅠ和Ⅱ、CINⅢ級(jí)組織中的表達(dá)差異 ICC組織中 miRNA-21表達(dá)(8.19±1.96)較 CINⅢ級(jí)(5.19±1.75)及CINⅠ和Ⅱ級(jí)(3.78±0.81)病變明顯升高(P＜0.001)。CINⅠ和Ⅱ級(jí)、CINⅢ級(jí)組織中的miRNA-21表達(dá)也存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.007)。

2.3 不同宮頸病變中miRNA-21表達(dá)及HPV16表達(dá)之間的關(guān)系 miRNA-21在 HPV16陽(yáng)性病變組織中的相對(duì)表達(dá)量為4.62±0.74，明顯高于HPV16陰性病變組織中的表達(dá)(3.57±0.70)(P=0.014)。ICC和CIN I和Ⅱ級(jí)病變中，HPV16陽(yáng)性病變組織中存在miRNA-21高表達(dá)的趨勢(shì)，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CINⅢ級(jí)病變中，在HPV16陽(yáng)性和陰性組織中miRNA-21表達(dá)存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

表1 不同宮頸病變中HPV16陽(yáng)性、陰性組miRNA-21表達(dá)比較(s)

表1 不同宮頸病變中HPV16陽(yáng)性、陰性組miRNA-21表達(dá)比較(s)

與HPV16陽(yáng)性比較:1)P＜0.05

HPV16 ICC CINⅢ CIN I和 Ⅱ陽(yáng)性 8.69±1.98 6.04±1.81 4.62±0.74陰性 6.48±0.18 4.15±0.991) 3.57±0.70

3 討論

microRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用，參與生物細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡等重要生理及病理過程〔8～11〕。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用，其表達(dá)量在各種腫瘤中均出現(xiàn)明顯上升，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和對(duì)治療的抵抗等生物學(xué)行為都有關(guān)系〔3，5，9，12，13〕。目前關(guān)于miRNA-21在宮頸癌前病變及子宮頸癌病變中的研究還很有限。提示miRNA-21的表達(dá)失調(diào)可能在子宮頸上皮由癌前病變發(fā)展到子宮頸癌的過程中持續(xù)發(fā)揮作用。Yao等〔14〕應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和原位雜交檢測(cè)技術(shù)研究了宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中和細(xì)胞株中miRNA-21的表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中和細(xì)胞株均存在miRNA-21的高表達(dá)，并且在宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中miRNA-21表達(dá)上調(diào)可能與HPV16陽(yáng)性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示miRNA-21在ICC癌前病變階段及由癌前病變進(jìn)展到ICC過程中隨著病情發(fā)展其表達(dá)量呈現(xiàn)明顯的上升，提示miRNA-21有可能成為新的檢測(cè)宮頸癌的早期指標(biāo)之一。已有研究報(bào)道血清標(biāo)本中的miRNA-21可作為結(jié)腸癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物〔15〕。

細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究顯示了miRNA-21表達(dá)上調(diào)可能與HPV16陽(yáng)性有關(guān)聯(lián)。由于病例數(shù)有限，在ICC和CINⅠ和Ⅱ級(jí)組織中miRNA-21在HPV16陽(yáng)性和陰性病變中表達(dá)雖然不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是都呈現(xiàn)了HPV16陽(yáng)性病變中更高的表達(dá)。上述研究結(jié)果提示miRNA-21失調(diào)及表達(dá)量的增加可能與HPV陽(yáng)性子宮頸癌前病變和ICC的發(fā)生有密切關(guān)系。

1 李小華，王俊然，冬國(guó)友，等.高危型人乳頭瘤樣病毒DNA檢測(cè)在宮頸癌早期篩查中作用〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2013;3(42):939-40.

2 Lages E，Ipas H，Guttin A，et al.MicroRNAs:molecular features and role in cancer〔J〕.Front Biosci(Landmark Ed)，2012;17:2508-40.

3 Huang Y，Yang YB，Zhang XH，et al.MicroRNA-21 gene and cancer〔J〕.Med Oncol，2013;30(2):376.

4 Haigl B，Vanas V，Setinek U，et al.Expression of microRNA-21 in nonsmall cell lung cancer tissue increases with disease progression and is likely caused by growth conditional changes during malignant transformation〔J〕.Int J Oncol，2014:44:1325-34.

5 Chen J，Wang X.MicroRNA-21 in breast cancer:diagnostic and prognostic potential〔J〕.Clin Transl Oncol，2014:16(2):225-33.

6 Zeng Z，Wang J，Zhao L，et al.Potential role of microRNA-21 in the diagnosis of gastric cancer:a meta-analysis〔J〕.PLoS One，2013;8:e73278.

7 Thorland EC，Myers SL，Gostout BS，et al.Common fragile sites are preferential targets for HPV16 integrations in cervical tumors〔J〕.Oncogene，2003:22:1225-37.

8 陳軍瑩，姚德生.microRNA在宮頸癌中的研究進(jìn)展〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2011;5(40):1529-32.

9 楊 旸，康春生.miRNA-21與腫瘤相關(guān)研究新進(jìn)展〔J〕中國(guó)腫瘤臨床，2011;38(6):357-60.

10 湯文凡，劉朝奇，佐滿珍.miRNA在宮頸癌早期診斷中的應(yīng)用及其價(jià)值探討〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012;1:30-2.

11 朱耀魁，程 妮，胡 穎，等.微RNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中作用及其與HPV相互關(guān)系〔J〕.生理科學(xué)進(jìn)展，2012;43(4):251-6.

12 王 玉，席樂峰，楊廷桐.C-myc與肺鱗癌中miRNA-21表達(dá)的關(guān)系〔J〕.解剖學(xué)雜志，2013;36(4):758-61.

13 劉四明，李 剛，佟 明，等.miRNA-21在前列腺癌中的作用〔J〕.天津醫(yī)藥，2011;39(5):475-6.

14 Yao T，Lin Z.MiR-21 is involved in cervical squamous cell tumorigenesis and regulates CCL20〔J〕.Biochim Biophys Acta，2012;1822(2):248-60.

15 Toiyama Y，Takahashi M，Hur K，et al.Serum miR-21 as a diagnostic and prognostic biomarker in colorectal cancer〔J〕.J Natl Cancer Inst，2013:105(6):849-59.