李茜茜，鄒玲玲，黃雪麗，馮 芳，2#（.中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 20009；2.江蘇藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 20009）

替硝唑陰道泡騰片是一種特殊的新型制劑，主要用于治療滴蟲性陰道炎[1]。該藥在陰道中崩解、釋放，直接作用于病變部位發(fā)揮藥效，具有起效快、生物利用度高、不良反應(yīng)小、高度靶向等特點(diǎn)。由于用藥部位的特殊性，采用傳統(tǒng)的溶出度測定方法（如轉(zhuǎn)籃法、槳法及小杯法）無法模擬藥物在體內(nèi)的溶出環(huán)境，因此建立適宜的體外溶出分析方法，對于考察研發(fā)制劑與參比制劑的一致性，研究仿制藥物的制劑工藝，進(jìn)行質(zhì)量控制十分必要。

流通池法是一種新型溶出度測定方法，為《美國藥典》（36版）和《歐洲藥典》（8版）收載的溶出測定第4法。其采用開放體系測定方式，待測樣品可在連續(xù)更新的介質(zhì)環(huán)境中溶出，流速為1.5～35ml/min，適用于特殊劑型（如陰道用藥相關(guān)劑型）的制劑工藝研究[2]。為此，在本研究中筆者采用流通池法，觀察了溶出介質(zhì)、溶出液流速及取樣時(shí)間等因素對替硝唑陰道泡騰片溶出度的影響，繪制研發(fā)制劑與參比制劑的溶出曲線，比較相似因子和分析威布爾參數(shù)，從而評(píng)價(jià)兩種制劑的一致性。

1 材料

CE7smart溶出儀（瑞士SOTAX公司）；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（南京科爾儀器設(shè)備有限公司）；UV-3100掃描型紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；Libror AEC-210電子天平（日本島津公司）。

替硝唑原料藥（A制藥公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：100.4%）；空白輔料（A制藥公司）；替硝唑陰道泡騰片（參比制劑，四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：110301，規(guī)格：0.2g/片）；替硝唑陰道泡騰片（研發(fā)制劑，A制藥公司，批號(hào)：110401、110402、110403，規(guī)格：0.2g/片）；磷酸二氫鈉和檸檬酸均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 溶出介質(zhì)的制備 甲溶液：取檸檬酸21g或無水檸檬酸19.2g，加水溶解成1000ml，置冰箱中保存。乙溶液：取磷酸二氫鈉71.63g，加水溶解成1000ml。取上述甲溶液61.45 ml和乙溶液38.55ml混合，搖勻，即得檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液（pH4.0）。

2.1.2 對照品貯備液的制備 精密稱取替硝唑原料藥20.00 mg，共兩份，分別置于不同的100ml量瓶中，分別加水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度均為200μg/ml的對照品貯備液A和B。

2.1.3 空白對照貯備液的制備 精密稱取空白輔料40.00mg，共兩份，分別置于不同的100ml量瓶中，分別加水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液定容，搖勻，制成空白對照貯備液A和B。

2.1.4 模擬處方貯備液的制備 精密稱取含替硝唑原料藥20.00mg和空白輔料40.00mg的模擬處方兩份，分別置于不同的100ml量瓶中，分別加水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液定容，搖勻，制成替硝唑質(zhì)量濃度均為200μg/ml的模擬處方貯備液A和B。

2.1.5 供試品溶液的制備 流通池儀器自動(dòng)取樣裝置分別于不同取樣點(diǎn)收集溶出液10ml，經(jīng)0.45μm的水性濾膜濾過后，分別加水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液稀釋不同倍數(shù)（吸光度A為0.3～0.7），搖勻，即得。

2.2 溶出度測定方法

采用開放式流通池法，將替硝唑陰道泡騰片置于錐形部裝滿1mm玻璃珠的流通池內(nèi)，分別以脫氣處理的水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液為溶出介質(zhì)，在流通池內(nèi)以層流方式流動(dòng)，溫度為37℃。流速為3ml/min時(shí)，于2、4、8、10、15、20、30、45、60min收集溶出液；流速為2ml/min時(shí)，于2、4、8、10、15、20、30、45、60、90min收集溶出液。溶出液經(jīng)0.45μm水性濾膜濾過后稀釋，采用紫外-可見分光光度法在315nm波長處測定吸光度。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下對照品貯備液A和B各3ml，分別置于不同的50ml量瓶中，分別加水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液定容，得替硝唑質(zhì)量濃度均為12μg/ml的兩種對照品溶液；取“2.1.4”項(xiàng)下模擬處方貯備液A和B各3ml，分別置于不同的50ml量瓶中，分別加水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液定容，得替硝唑質(zhì)量濃度均為12μg/ml的兩種模擬處方溶液；取“2.1.3”項(xiàng)下空白對照貯備液A和B各3ml，分別置于不同的50ml量瓶中，分別加水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液定容，得兩種空白對照溶液。取上述各溶液約3ml，置于不同的比色皿中進(jìn)行紫外掃描，光譜詳見圖1。由圖1可見，空白對照在315nm波長及附近無紫外吸收，說明替硝唑陰道泡騰片在315nm波長處的溶出曲線專屬性良好。

2.4 模擬處方溶液濾膜吸附性試驗(yàn)

取“2.1.4”項(xiàng)下模擬處方貯備液A 1、3、5ml，分別置于不同的50ml量瓶中，加水定容，得替硝唑質(zhì)量濃度分別為4、12、20μg/ml的模擬處方溶液Ⅰ；取“2.1.4”項(xiàng)下模擬處方貯備液B 1、3、5ml，分別置于不同的50ml量瓶中，加檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液定容，得替硝唑質(zhì)量濃度分別為4、12、20μg/ml的模擬處方溶液Ⅱ，各濃度平行3份。計(jì)算兩種模擬處方溶液未濾過、棄去濾液1ml、棄去濾液3ml后的吸光度差異，結(jié)果見表1。

2.5 溶出液濾膜吸附性試驗(yàn)

在3ml/min流速下，分別取參比制劑（批號(hào)：110301）與研發(fā)制劑（批號(hào)：110401）在水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液中于8、15、45min時(shí)的溶出液。參比制劑與研發(fā)制劑均分別考察2次（即參比制劑110301-1與參比制劑110301-2，研發(fā)制劑110401-1與研發(fā)制劑110401-2）。計(jì)算在兩種介質(zhì)中不同時(shí)間點(diǎn)的溶出液未濾過、棄去濾液1ml、棄去濾液3ml后的吸光度差異，結(jié)果見表2。

表1 模擬處方溶液濾膜吸附性試驗(yàn)（n＝3）Tab 1 Membrane adsorption test of simulated prescription solution（n＝3）

表2 溶出液濾膜吸附性試驗(yàn)Tab 2 Membrane adsorption test of dissolution fluid

2.6 線性關(guān)系考察

文獻(xiàn)報(bào)道，紫外分光光度法測定替硝唑的線性范圍約2～24μg/ml[3-5]。取“2.1.2”項(xiàng)下對照品貯備液A 1、1.5、2、3、4、5 ml，分別置于不同的50ml量瓶中，加水定容，制成質(zhì)量濃度為4、6、8、12、16、20μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液Ⅰ；取“2.1.2”項(xiàng)下對照品貯備液B 1、1.5、2、3、4、5ml，分別置于不同的50ml量瓶中，加檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液定容，制成質(zhì)量濃度為4、6、8、12、16、20μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液Ⅱ。測定上述兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的吸光度，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得替硝唑在水為溶出介質(zhì)時(shí)的回歸方程y＝0.0365x－0.0004（r＝0.9999）；在檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液為溶出介質(zhì)時(shí)的回歸方程y＝0.0358x－0.0014（r＝0.9999）。結(jié)果表明，替硝唑檢測質(zhì)量濃度在4～20μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下兩種模擬處方溶液，各濃度平行3份，進(jìn)行紫外掃描測定吸光度。結(jié)果，以水為溶出介質(zhì)時(shí)，RSD分別為0.58%、0.20%、0.07%；以檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液為溶出介質(zhì)時(shí)，RSD分別為0.38%，0.44%，0.18%。表明本法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下對照品貯備液A 1、3、5ml，分別置于不同的50ml量瓶中，加水定容，制成替硝唑質(zhì)量濃度分別為4、12、20μg/ml的對照品溶液Ⅰ；取“2.1.2”項(xiàng)下對照品貯備液B 1、3、5ml，分別置于不同的50ml量瓶中，加檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液定容，制成替硝唑質(zhì)量濃度分別為4、12、20μg/ml的對照品溶液Ⅱ，各濃度平行3份。取上述兩種對照品溶液和“2.4”項(xiàng)下兩種模擬處方溶液，于室溫放置0、2、4、8、12h時(shí)測定其吸光度，結(jié)果見表3。由表3可見，對照品溶液和模擬處方溶液在12h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)（n＝3）Tab 3 Stability test（n＝3）

2.9 溶出度測定

取參比制劑（批號(hào)：110301）與研發(fā)制劑（批號(hào)：110401、110402、110403）適量，分別加水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，取在2ml/min與3ml/min流速下不同取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出液，按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用紫外-可見分光光度法測定吸光度，計(jì)算累積溶出百分率，結(jié)果見表4。

表4 替硝唑陰道泡騰片累積溶出百分率（%，n＝6）Tab 4 Cumulative dissolution percentage of Tinidazole vaginal effervescent tablets（%，n＝6）

2.10 體外溶出數(shù)據(jù)分析

采用相似因子比較及威布爾參數(shù)分析，比較研發(fā)制劑與參比制劑溶出行為的相似性。

2.10.1 相似因子比較 溶出曲線相似性的評(píng)價(jià)方法曾有多種，但自1999年美國食品與藥品管理局推薦采用f2相似因子比較法以來，該法已被普遍采用[6]。通過計(jì)算f2予以判斷，f2值的范圍在0～100，f2值越大，兩條曲線的相似性越高，f2值大于50即可判定為相似[6]。在本研究中，筆者比較了參比制劑（批號(hào)：110301）與研發(fā)制劑（批號(hào)：110401、110402、110403）在2 ml/min和3ml/min兩種流速下，在水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液兩種介質(zhì)中的溶出曲線差異，并且計(jì)算相似因子f2。依照相似因子計(jì)算的一般規(guī)則，選擇溶出間隔相近的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較。流速為3ml/min時(shí)，2、4、8、15min 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的溶出百分率均為20%左右，因此選擇以上4個(gè)點(diǎn)對參比制劑與研發(fā)制劑進(jìn)行比較。流速為2ml/min時(shí)，2、4、8、10、15min 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的溶出百分率均在10%～15%，因此選擇以上5個(gè)點(diǎn)對上述制劑進(jìn)行比較。根據(jù)f2相似因子的計(jì)算公式[7]：參比制劑平均累積溶出百分率，Ti：研發(fā)制劑平均累積溶出百分率），結(jié)果f2均大于50，表明研發(fā)制劑與參比制劑的溶出曲線相似，詳見表5。

表5 相似因子f2計(jì)算結(jié)果Tab 5 f2 values of the similarity factor

2.10.2 威布爾參數(shù)分析 威布爾方程既能反映制劑工藝情況、工藝的內(nèi)在差異，又能反映制劑的溶出快慢情況[8]，與相似因子結(jié)果相互補(bǔ)充，可更加全面地比較研發(fā)制劑與參比制劑的相似程度。筆者利用威布爾分布模型提取溶出參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)威布爾分布函數(shù)導(dǎo)出威布爾分布函數(shù)表達(dá)式：ln用此公式擬合藥物溶出曲線方程，并計(jì)算特征溶出參數(shù)T50（藥物溶出50%所需時(shí)間）和Td（藥物溶出63.2%所需時(shí)間）。在不同流速下，分別將研發(fā)制劑（批號(hào)：110401、110402、110403）的T50和Td與參比制劑（批號(hào)：110301）的T50和Td進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明，研發(fā)制劑溶出參數(shù)與參比制劑的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表6。

表6 威布爾參數(shù)計(jì)算結(jié)果Tab 6 The results of Weibull distribution parameters

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

替硝唑結(jié)構(gòu)中含有硝基咪唑基團(tuán)，具有較強(qiáng)的紫外吸收，在水和檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液中的最大吸收波長均為315nm，而空白輔料在此波長處無吸收，因此采用紫外-可見分光光度法對替硝唑陰道泡騰片的溶出度進(jìn)行測定。

3.2 溶出介質(zhì)的選擇

《日本醫(yī)療用藥品品質(zhì)情報(bào)集》（橙皮書）中替硝唑片劑溶出曲線的測定是采用水和pH分別為1.2、4.0、6.8的緩沖液為溶出介質(zhì)[10]?？紤]到替硝唑陰道泡騰片用藥部位的特殊性，參照文獻(xiàn)報(bào)道陰道內(nèi)的pH為3.8～5[11-12]，故最終選擇水和pH 4.0的緩沖液作為溶出介質(zhì)。

3.3 流速及取樣時(shí)間點(diǎn)的選擇

通常流通池法測定時(shí)，選擇流速 16、8、4ml/min[2，13]。考慮到替硝唑陰道泡騰片特殊的使用環(huán)境（蠕動(dòng)較慢），試驗(yàn)中首先在4ml/min流速下，取樣時(shí)間點(diǎn)為5、15、30、60、90min和2、3、4、5、6h時(shí)，考察其溶出行為。結(jié)果顯示，在此條件下替硝唑陰道泡騰片的溶出速度很快，5min時(shí)累積溶出百分率達(dá)50%，60min以后替硝唑溶出幾近完全。故將4ml/min流速時(shí)取樣時(shí)間點(diǎn)調(diào)整為2、4、8、10、15、20、30、45、60min。進(jìn)一步降低流速，在3，2、1.5ml/min流速條件下分別測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3ml/min流速下，替硝唑60min時(shí)的溶出基本完成，而2 ml/min和1.5ml/min流速下，60min時(shí)替硝唑的溶出尚未完全，因此后兩個(gè)流速條件下取樣時(shí)間點(diǎn)延長至90min。不同流速下的替硝唑陰道泡騰片累積溶出曲線詳見圖2（批號(hào)：110402，介質(zhì)：水）。

圖2 不同流速下的替硝唑陰道泡騰片累積溶出曲線Fig 2 Cumulative dissolution profiles of Tinidazole vaginal effervescent tablet at different flow rates

由圖2可見，流速為4ml/min和3ml/min時(shí)溶出行為相似；流速為2ml/min和1.5ml/min時(shí)，溶出速度減緩，尤其是后者在90min時(shí)，累積溶出百分率仍小于75%。為了充分比較參比制劑與研發(fā)制劑溶出行為的異同，最終確定3ml/min和2 ml/min作為試驗(yàn)用流速，取樣時(shí)間分別為2、4、8、10、15、20、30、45、60min和2、4、8、10、15、20、30、45、60、90min。

綜上所述，筆者建立的方法簡單、快速，可用于替硝唑陰道泡騰片溶出度的測定。

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