張大偉 呂恒娟 劉貴波 李明秋 (牡丹江醫(yī)學院，黑龍江 牡丹江 570)

隨著人們對腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的研究不斷深入，關(guān)于淋巴管內(nèi)皮細胞(LECs)的形態(tài)學特征、生理功能、生物特性及其在病理過程的作用也逐漸成為研究熱點。1984年Jottstcm和Walker首次成功地分離、培養(yǎng)了牛腸系膜LECs，并觀察了其形態(tài)學特征〔1〕。近年來，隨著分子生物學和細胞培養(yǎng)技術(shù)的飛速發(fā)展，許多學者成功地進行了多種組織的 LECs離體培養(yǎng)〔2～6〕。本研究從原代培養(yǎng)豬胸導來源的內(nèi)皮細胞入手，研究LECs的形態(tài)學特性，并創(chuàng)建了可靠的培養(yǎng)方法，將為今后進一步研究LECs的功能和在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用機制提供可靠的材料。

1 材料和方法

1.1 材料 取豬胸主動脈及其后面的組織(其內(nèi)含胸異管)，用含有雙抗(含青霉素鏈霉素各200 U/ml)和兩性霉素 B 50 U/ml預冷的D-Hanks沖洗3次，盡可能去除血液和雜質(zhì)，然后放入裝有含雙抗的D-Hanks液瓶中，置于冰袋預冷的保溫箱內(nèi)送實驗室，立即進行試驗。

1.2 LECs的分離純化培養(yǎng)及傳代 將胸導管兩端游離，并插入導管，用止血鉗將近心端導管結(jié)扎，在遠心端向胸導管內(nèi)注入膠原酶(1 g/L)，至胸導管充盈為止。將其置于37℃的恒溫箱內(nèi)消化10～15 min，用培養(yǎng)液加壓沖洗管腔，將消化液和沖洗液離心(1 000 r/min，10 min)，吸去上清液，用培養(yǎng)液輕輕混懸細胞。將細胞接種于預先用明膠或多聚賴氨酸噴涂的培養(yǎng)皿中，然后置于37℃，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔2～3 d更換培養(yǎng)液1次。約10%細胞匯合生長形成單層。當內(nèi)皮細胞生長形成單層時，進行1∶3傳代培養(yǎng)。

1.3 免疫熒光染色鑒定LECs 原代LECs傳代于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)至60% ～80%，用預溫磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定60～90 min，PBS洗滌2次，0.5%Triton-100處理細胞30 min，PBS洗滌2次，山羊血清用PBS按1∶10的比例稀釋后室溫封閉20 min，后棄去多余液體，分別用鼠抗人血管皮生長因子受體(VEGR)-3(1∶200)，淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)(1∶400)抗體4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，羊來源的二抗(1∶100)室溫孵育30 min，PBS洗滌2次，鏈霉親合素-生物素復合物(SABC)-異硫氰酸熒光素(FITC)(1∶100)室溫孵育30 min，PBS洗滌4次，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照分析。

1.4 透射電鏡觀察LECs超微結(jié)構(gòu) 收集培養(yǎng)的豬胸導管內(nèi)皮細胞，離心后用3%戊二醛固定，1%鋨酸固定，經(jīng)脫水、浸透、包埋，制成半薄切片，然后制成超薄切片，透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 細胞的原代培養(yǎng)及傳代 原代細胞培養(yǎng)3～5 h后，大部分活力較高的內(nèi)皮細胞完成貼壁;12～24 h后，內(nèi)皮細胞已鋪展形成由數(shù)個細胞組成的細胞群，每群細胞數(shù)目不等，形態(tài)呈梭形;培養(yǎng)18～24 h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在2～3 d內(nèi)，細胞生長緩慢，1 w后細胞分裂旺盛，進入對數(shù)生長期;10 d后，細胞呈生長密集狀并匯合形成單層，呈特征性“鵝卵石狀”或“鋪路石狀”鑲嵌排列生長并有接觸抑制現(xiàn)象，無重疊生長。當淋巴管內(nèi)皮細胞形成單層時進行傳代培養(yǎng)，25～30 min后，淋巴管內(nèi)皮細胞開始貼壁生長，傳代培養(yǎng)1 w后內(nèi)皮細胞匯合形成單層。見圖1。

圖1 細胞原代培養(yǎng)(×100)

2.2 免疫熒光染色鑒定LECs 免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)實驗中所分離的細胞絕大部分均表達淋巴管內(nèi)皮細胞標記分子LYVE-1和VEGFR-3。綜合分析該細胞的純度＞95%，淋巴管內(nèi)皮細胞特征明確，可以用于后續(xù)實驗。見圖2。

2.3 LECs超微結(jié)構(gòu) 在透射電鏡下，內(nèi)皮細胞呈卵圓形、短梭形、多角形或不規(guī)則形，從細胞膜上偶有一些長的突起。細胞核大，核仁清晰，細胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的吞飲小泡，并有較多的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在對數(shù)生長期可見雙核仁。見圖3。

圖2 免疫熒光染色鑒定LECs

圖3 透射電鏡觀察LECs超微結(jié)構(gòu)

3 討論

LECs在多次傳代后性狀會發(fā)生改變，因此在目前階段認為原代培養(yǎng)LECs是比較可靠的實驗方法，而LECs的長期培養(yǎng)建系長期以來都是一個難題。取材過程中傳統(tǒng)方法是把胸導管完全游離，用鑷子和眼科剪子仔細剝除胸導管表面的脂肪和纖維組織〔5～7〕，但在修剪胸導管過程中，常把胸導管小的屬支剪斷，使胸導管有一些漏點，以至于很難取到足夠長的胸導管進行消化。

LECs活力有限，對培養(yǎng)條件要求較高。ECM是培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的專用培養(yǎng)基，其含有必需氨基酸、維生素和無機鹽;ECGS能顯著提高細胞的活力，縮短細胞的生長周期，未加入ECGS的培養(yǎng)基接種LECs后發(fā)現(xiàn)其擴增有限，難以生長。

目前 LECs的標記分子如 LYVE-1，VEGFR-3，Prox-1，Podoplanin等已經(jīng)得到國內(nèi)外學者的證實，其特異性均比較高〔8～11〕。本文采用兩種標記分子對所培養(yǎng)的細胞進行免疫熒光細胞化學鑒定，排除所培養(yǎng)的細胞不是LECs的可能，尤其是在消化過程中可能造成污染的成纖維細胞和平滑肌細胞的干擾，同時也排除了生物學特性與LECs相近的微血管內(nèi)皮細胞的可能。目前也有研究報道部分炎性細胞如腫瘤相關(guān)巨噬細胞，樹突細胞也可表達LYVE-1〔12〕，但是此類細胞在本實驗條件下難以生長。結(jié)果表明培養(yǎng)的LECs純度比較高，達到95%可以用于進一步的實驗。

透射電鏡觀察到，LECs胞質(zhì)內(nèi)有發(fā)達的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，說明培養(yǎng)的淋巴管內(nèi)皮功能較活躍。胞質(zhì)中有豐富的吞飲小泡，這些小泡有運輸物質(zhì)的作用，這表明細胞有很強的吞飲能力。內(nèi)皮細胞核淡染，以常染色質(zhì)為主，核仁大而明顯。在對數(shù)生長期細胞核內(nèi)可見雙核仁，這表明LECs具有旺盛的增殖分裂能力。此外，該細胞在體外培養(yǎng)至第3代時仍保持了內(nèi)皮細胞的特性。

本實驗改進了膠原酶灌注消化豬胸導管得到LECs的方法，可以用較少的材料獲得數(shù)量和純度均較高的LECs，成功率高，這為進一步研究LECs生理功能、免疫反應、生長發(fā)育提供有效的平臺。此外，本實驗還觀察了LECs的超微結(jié)構(gòu)，為進一步研究LECs提供了形態(tài)學依據(jù)。

1 Jonston MG，Walker MA.Lymphatic endothelial and smooth-muscle cells in tissue culture〔J〕.In Vitro，1984;20(7):556-72.

2 Gnepp DR，Chandler W.Tissue culture of human and canine thoracic duct endothelium〔J〕.In Vitro Cell Dev Biol，1985;21(4):200.

3 Leak LV，Jones M.Lymphatic endothelium isolation，characterization and long term culture〔J〕.Anat Rec，1993;236(4):641.

4 譚玉珍，王海杰.細胞外基質(zhì)對體外淋巴管新生的作用〔J〕.解剖學報，2002;33(1):69-73.

5 遲曉艷，邵旭建.血管生成抑制素和反應停對淋巴管內(nèi)皮細胞生成的影響〔J〕.解剖學雜志，2005;28(5):513-6.

6 謝方民，程園園，邵旭建.內(nèi)抑制素和血小板因子-4對淋巴管內(nèi)皮細胞生成的影響〔J〕.解剖學報，2005;36(4):386-9.

7 劉 超，高慧婕，邵旭建.血管內(nèi)皮抑制因子α-干擾素和γ-干擾素對淋巴管內(nèi)皮細胞增殖和游走的影響〔J〕.解剖學雜志，2007;30(1):16-21.

8 Banerji S，Ni J，Wang SX，et al.LYVE-1，a new homologue of the CD44 glycoprotein，is a lymph-specific receptor for hyaluronan〔J〕.J Cell Biol，1999;144(4):789-801.

9 Nojiri H，Ohhashi T.lmmunolocalization of nitric oxide synthase and VEGF receptors in cultured lymphatic endothelial cells〔J〕，Microcirculation，1999;6(1):75-8.

10 Wigel JT，Oliver G.Prox l function is required for the development of the mlurine lymphatic system〔J〕.Cell，1999;98(6):769-78.

11 Sehlingenmann RO，Dingian GM，Emeis JJ.Monoclonal antibody PAL-E specific for endothelium〔J〕.Lab Invest，1985;52(1):71-6.

12 Rubbia-Brandt L，Terris B，iostra E，et al.Lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor-C expression correlate with malignant behavior in human pancreatic endocrine tumors〔J〕.Clin Cancer Res，2004;10(20):6919-28.