賈 楠 馬滌輝 常 明 宋月萍 詹 焱 (河北大學(xué)，河北 保定 0700)

阿爾茨海默病(AD)具體的病因和發(fā)病機制并不明了〔1～3〕。近年來眾多的實驗結(jié)果使越來越多的學(xué)者認(rèn)為中樞膽堿能系統(tǒng)損傷可能是各種原因所致癡呆的共同歸宿。乙酰膽堿(ACh)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在腦內(nèi)廣泛存在，其主要功能是維持意識的清醒，在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用。中樞膽堿能神經(jīng)元數(shù)量的減少、ACh合成減少、ACh受體和(或)敏感性降低、ACh通路的解剖異常等都可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能的障礙。各種動物實驗?zāi)Ｐ途荒芡暾M人類癡呆的復(fù)雜病理及發(fā)病機制。每一種模型僅從一種角度驗證某一種假說。機械切斷海馬通路是從膽堿能損傷的角度來設(shè)計的。本文通過2-維差異凝膠電泳的技術(shù)來檢測膽堿能損傷后的AD大鼠模型腦內(nèi)蛋白質(zhì)的改變情況，以期可以檢測一些相關(guān)的蛋白改變。

1 材料和方法

1.1 動物模型的制備和標(biāo)本的留取 實驗動物選取:用水迷宮篩選反應(yīng)迅速、活躍、健康及清潔級雄性Wistar大鼠，鼠齡3～4個月，體重200～220 g，分籠喂養(yǎng)隨機選取10只為1組(分為正常組、模型組)。大鼠由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

用10%水合氯醛腹腔注射(0.3～0.33 ml/100 g)麻醉大鼠。將頭部固定在立體定向儀上，剪毛消毒，暴露顱骨，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，橫斷穹窿海馬傘。上提刀片確定無出血后用骨蠟封閉創(chuàng)口，并在切口處撒少許青霉素粉劑抗炎，縫合皮膚。皮膚切開處給予少許青霉素粉劑，縫合切口即可。動物模型的制備2 w后對不同實驗組大鼠進行morris水迷宮等實驗確定為AD模型制備成功〔4～6〕。所有實驗動物的飼養(yǎng)均依據(jù)中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的實驗動物的飼養(yǎng)與使用標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 腦蛋白質(zhì)的提取 造模成功后隨機選取各實驗組Wistar大鼠4只，斷髓取腦，分離海馬。對不同個體選擇同一部位，切取同一大小組織稱重后，在勻漿器中加入10倍量裂解液(30 mmol/L Thiourea，7M 尿素，4%CHAPS，1%蛋白酶抑制劑和核酸酶)，冰浴勻漿，室溫裂解30 min后，15℃ 19 500 r/min離心30 min，收集上清液。應(yīng)用Clean-up試劑盒去除樣品雜質(zhì)，然后用2D Quant定量試劑和進行蛋白定量。

1.2.2 熒光差異雙向凝膠電泳(DIGE)實驗鼠海馬蛋白定量后，留取內(nèi)標(biāo)。分析膠:對內(nèi)標(biāo)蛋白、假手術(shù)對照組蛋白、實驗組蛋白分別進行熒光(cy2、cy3、cy5)標(biāo)記。按標(biāo)準(zhǔn)實驗流程:水化、等電聚焦電泳，采用線性IPG膠條，進行定量蛋白上樣，設(shè)定水化及電泳所需條件、此后灌制24×20 cm PAGE膠，此后進行IPG膠條平衡和轉(zhuǎn)移，電泳儀垂直電泳。

1.2.3 圖像分析統(tǒng)計學(xué)處理 Typhoon 9400激光掃描儀于熒光模式下進行成像掃描，掃描后的圖像文件用DeCyder差異分析軟件，找出差異表達蛋白點。蛋白的表達和匹配使用DeCyder-BP及DeCyder-BVA軟件進行，進行統(tǒng)計學(xué)處理(蛋白點含量升高或降低20%以上認(rèn)為有差異)。選取有意義蛋白點進行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果

正常組大鼠與AD模型組大鼠海馬的蛋白點分析比較，此蛋白在AD模型組中表達增強，AV Ratio為1.45，出現(xiàn)率為100%(P＜0.05)。蛋白點從在制備膠上切下，進行質(zhì)譜分析，在NCBI上進行蛋白鑒定，經(jīng)鑒定為神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)。見圖 1，圖 2。

圖1 質(zhì)譜分析

圖2 兩組大鼠海馬蛋白點分析

3 討論

AD作為神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，一直是眾多學(xué)者研究的熱點，進行性的智能減退是本病的特點，膽堿能損傷是公認(rèn)的致病因素之一〔4～6〕。我們在對正常大鼠及AD模型大鼠的2-維差異凝膠電泳的海馬組織實驗中檢測到NSE含量的明顯變化。此結(jié)果在兩組模型大鼠的海馬、額葉的免疫組織化學(xué)實驗中同樣得到證實〔5〕。

烯醇化酶在生物體內(nèi)的糖酵解代謝途徑中發(fā)揮著廣泛的作用。其同工酶共五種:Q Q、B B、Y Y、Q B、Q Y，由免疫學(xué)性質(zhì)不同的Q、B、Y三種亞基組合組成。已有實驗證實烯醇化酶同工酶均存在于胞質(zhì)中。其中在神經(jīng)元及特定的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中存在的只有Y Y型的NSE。NSE在腦組織細胞的活性最高，外周神經(jīng)和神經(jīng)分泌組織的活性水平居中，最低值見于非神經(jīng)組織、血清和腦脊液。它被發(fā)現(xiàn)在與神經(jīng)內(nèi)分泌組織起源有關(guān)的腫瘤中，導(dǎo)致血清中NSE明顯升高。NSE主要作為一種腫瘤標(biāo)志物用來檢測小細胞肺癌，60%～81%小細胞肺癌病例的血清中NSE濃度升高〔7，8〕。雖然NSE濃度與轉(zhuǎn)移部位沒有相關(guān)性，但是與臨床分期、療效的評價及預(yù)后均有很好的相關(guān)性。此外多數(shù)的神經(jīng)母細胞瘤患者的血清NSE很高，且與病情預(yù)后相關(guān)。陽性率可達96% ～100%，測定血清NSE對該類腫瘤的早期診斷及預(yù)后判斷具有較高的臨床價值。另外，血清NSE升高還可見于甲狀腺髓樣癌、嗜鉻細胞瘤、轉(zhuǎn)移性精原細胞癌、黑色素瘤、胰腺內(nèi)分泌瘤等〔9～11〕。

膽堿能損傷可引起智能改變。而檢測智能改變的臨床指標(biāo)是多種的智能量表:癡呆量表 MMSE、HIS、ADL(20項)等。但量表分析受患者受教程度、理解能力以及個體的差異等多種因素影響。臨床腦電分析、神經(jīng)病理等也不能廣泛推廣。如果臨床上可以通過腦脊液或血液中某種特定指標(biāo)的檢測，來動態(tài)的判定疾病的進程、治療后的恢復(fù)程度、疾病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后;將對臨床疾病的診斷和治療起到一定的幫助作用。通過反復(fù)動物實驗，我們觀察到NSE的變化;鑒于NSE的存在特殊性，當(dāng)神經(jīng)元受到損傷后，NSE從細胞內(nèi)溢入，可進入腦脊液和血液。而腦組織中膠質(zhì)細胞和其他神經(jīng)組織不含NSE，那NSE是否也可以作為檢測腦損傷嚴(yán)重程度的客觀指標(biāo)，從另一角度反映神經(jīng)功能的缺失、智能改變的情況，是我們關(guān)心的問題，我們將對部分智能改變患者進行臨床實驗，以期可以尋找到有力的實驗室證據(jù)，為AD的臨床診斷和治療提供幫助。

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