李?lèi)?ài)連 胡志芳 史宏恩 (西安醫(yī)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室，陜西 西安 710021)

白細(xì)胞介素(IL)-18是一種常見(jiàn)的前炎癥因子，在感染、癌癥等各種疾病中發(fā)揮著重要作用〔1〕。IL-18通過(guò)增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK)與T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用與增強(qiáng)干擾素(IFN)活性等作用發(fā)揮抗感染、抗腫瘤與增強(qiáng)免疫能力等生物學(xué)活性，且與自身免疫性疾病、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)〔2〕。本文擬分析IL-18在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞由本科室常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑 DNA序列(上海博亞公司合成)，RNA提取、PCR擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pGEM-T載體、內(nèi)切酶、連接酶均從Santa Cruz公司購(gòu)入，RIPA緩沖液、Anti-IL-18小鼠單抗，Anti-actin小鼠多抗，顯色試劑盒從Promega公司購(gòu)入，G418、陽(yáng)離子脂質(zhì)體從Invitrogen公司購(gòu)入。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 RT-PCR 提取NSCLC細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，使用β2-微球蛋白(β2-BMG)作為內(nèi)參照，并按照PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明說(shuō)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件:變性94℃、30 s，退火 72℃、30 s，延伸 30 s，周期:28 個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)周期延伸(72℃、7 min)，引物序列①I(mǎi)L-18:(正)5'-GCCGGTACCCGCATGGGTGGTGAACGACTAGAA-3';(反)5'-GCGTCTAGAGTCTTCGTTTTGAAACAGTGAA-3';②β2-BMG:(正)5'-GCTATCGGAAGAGCAGCGTACTCCAAAGA-3'(反)5'-AACCTGCTCSGATACATCAAACAT-3'。

1.3.2 Western印跡技術(shù) 采用RIPA緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，采用β-actin作為試驗(yàn)組的內(nèi)參對(duì)照，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3 構(gòu)建IL-18重組顆粒與細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) 在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，從NSCLC細(xì)胞株中擴(kuò)增IL-18 cDNA，連接pGEM-T載體，內(nèi)切酶鑒定并進(jìn)行測(cè)序，成功構(gòu)建IL-18重組顆粒。采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)方法將IL-18真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NSCLC細(xì)胞株中，加入800 μg/μL的G418加壓獲取穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):將穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于培養(yǎng)液中，加入培養(yǎng)基，在血清條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:50 mg/L CO2、37℃中處理8 h，無(wú)水乙醇固定，高倍顯微鏡下檢查視野中的穿膜細(xì)胞，重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，取平均值進(jìn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IL-18在NSCLC高、低轉(zhuǎn)移中的蛋白與 mRNA表達(dá)Western印跡檢測(cè)結(jié)果表明:低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株未檢測(cè)到IL-18蛋白表達(dá)，高轉(zhuǎn)移的NSCLC細(xì)胞株的IL-18蛋白表達(dá)量高達(dá)3.98±2.01，兩者比較差異顯著(t=6.17，P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)IL-18蛋白表達(dá)

半定量RT-PCR顯示:低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株未檢測(cè)到IL-18 mRNA的表達(dá)，高轉(zhuǎn)移的NSCLC細(xì)胞株的IL-18 mRNA表達(dá)水平高達(dá)5.41±1.20，兩者比較差異顯著(t=8.09，P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 半定量RT-PCR檢測(cè)IL-18 mRNA表達(dá)

2.2 IL-18基因?qū)氚┑娃D(zhuǎn)移株后對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外遷移的影響 導(dǎo)入IL-18基因的NSCLC低轉(zhuǎn)移株的轉(zhuǎn)移能力為空白對(duì)照細(xì)胞株的3倍左右，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.34，P ＜0.05)。

3 討論

IL-18 具有誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子合成，誘導(dǎo)Th1輔助細(xì)胞分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞免疫功能等作用〔3〕。

IL-18在NSCLC病情發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。腫瘤轉(zhuǎn)移程度是由腫瘤組織轉(zhuǎn)移能力與免疫抑制腫瘤相互作用的結(jié)果決定的，研究〔4〕發(fā)現(xiàn):IL-18具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、免疫及血管生成的作用，能抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展及促進(jìn)腫瘤相關(guān)重要因子的合成。IL-18通過(guò)免疫激活作用實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤發(fā)展的作用，表現(xiàn)在直接或間接啟動(dòng)IFN-γ的活性、加強(qiáng)T細(xì)胞的增殖能力〔5〕。IL-18促進(jìn)NK細(xì)胞的毒性效應(yīng)，在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移鼠模型中，脾內(nèi)注射IL-18后，血清中的一氧化碳(CO)水平顯著升高，巨噬細(xì)胞毒性增強(qiáng)，提示IL-18可顯著增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用〔6〕。有研究〔7〕證實(shí)了轉(zhuǎn)染IL-18穩(wěn)定性骨髓基質(zhì)干細(xì)胞株對(duì)腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有明顯的抑制作用。楊文剛等〔8〕也同樣證實(shí)了IL-18基因轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞株增殖顯著減慢，轉(zhuǎn)移與侵襲能力顯著減弱，推測(cè)IL-18通過(guò)影響免疫功能與增加NK細(xì)胞的毒性效應(yīng)發(fā)揮明顯的抗腫瘤作用。IL-18對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移程度影響的研究少，尚無(wú)可證實(shí)IL-18抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的確切報(bào)道〔9〕。以往研究〔10〕采用外周血單核細(xì)胞作為IL-18的擴(kuò)增模板，在細(xì)胞組織研究中的可信度不高，本研究采用細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA作為模板，不僅為研究IL-18提供了新的路徑，還可提高研究的可靠程度。

本研究提示IL-18在NSCLC的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。擴(kuò)增的IL-18基因序列與GenBank公布的序列相符，無(wú)基因突變出現(xiàn)，揭示了IL-18在NSCLC高轉(zhuǎn)移中組成性表達(dá)。有關(guān)研究〔11〕表明IL-18通過(guò)促進(jìn)肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞的血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)生成促進(jìn)腫瘤肝轉(zhuǎn)移，但也有研究〔12〕表明IL-18通過(guò)降低IL-6水平抑制肝癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移。目前為止，對(duì)于IL-18在腫瘤中的生物學(xué)活性尚有爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步探討。

1 賴遠(yuǎn)波，陳淡森.揭陽(yáng)地區(qū)漢族人群白細(xì)胞介素18基因啟動(dòng)子多態(tài)性與結(jié)核病的相關(guān)性〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2013;34(16):2553-5.

2 周喜云.大腸癌術(shù)后患者營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)與血清中腫瘤壞死因子-α、IL-18和IL-23的關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013;33(17):4340-1.

3 閉肇龍，侯恩存，吳 波，等.血清IL-18對(duì)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后價(jià)值〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013;23(22):34-7.

4 邵 奇，王 寧.白細(xì)胞介素-18與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究現(xiàn)狀〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2012;19(7):547-52.

5 Bian C，Wang ZC，Yang JL，et al.Up-regulation of interleukin-23 induces persistent allodynia via CX3CL1 and interleukin-18 signaling in the rat spinal cord after tetanic sciatic stimulation〔J〕.Brain Behav Immun，2013;1591(13):596-5.

6 陳志芬，鄧長(zhǎng)生，馮茂輝，等.人白細(xì)胞介素-15與18協(xié)同增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞體內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷功能〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010;27(8):1041-5.

7 蔣常文，夏春波，李鴻文，等.外源性IL-18基因表達(dá)對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲力和克隆形成的影響〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2010;4(10):2001-3.

8 楊文剛，劉俊華，陳嘉寶，等.白細(xì)胞介素-18mRNA在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011;19(12):2426-8.

9 蔣代鳳，邢桂春，陳筱瀟，等.白細(xì)胞介素18在肺癌細(xì)胞的表達(dá)及其在腫瘤轉(zhuǎn)移中功能的初步探討〔J〕.免疫學(xué)雜志，2003;19(5):355-60.

10 蔣常文，夏春波，李鴻文，等外源性IL-18基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用〔J〕.山東醫(yī)藥，2010;50(31):13-5.

11 張?jiān)谠?，李曉梅，王涓?IL-18基因修飾對(duì)肺癌細(xì)胞來(lái)源exosome誘導(dǎo)殺傷腫瘤細(xì)胞作用的影響〔J〕.中國(guó)病理生理雜志，2011;27(9):1758-61.

12 Krzanowski M，Janda K.Dumnicka P-Relationship between aortic pulse wave velocity，selected proinflammatory cytokines，and vascular calcification parameters in peritoneal dialysis patients〔J〕.J Hypertens，2014;32(1):142-8.