韓 磊 金 宏 孫文萍 田 晶 紀(jì)鵬艷 齊 玲 于洪泉

(吉林醫(yī)藥學(xué)院病理教研室，吉林 吉林 132013)

五味子是長白山的特色藥材，是吉林省中藥的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)。研究表明，五味子具有抗腫瘤作用，其抗腫瘤活性部位主要是五味子木脂素和多糖〔1〕。在所有惡性腫瘤中，腦腫瘤由于位置的特殊性，給患者的生命和健康帶來了極大的威脅，也使患者的生活質(zhì)量明顯下降。研究表明，腦腫瘤干細(xì)胞(BTSCs)是腦腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)和耐藥的根源〔2〕，但目前仍缺乏有效的治療藥物。本課題組研究表明，五味子木脂素可明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長〔3〕，順鉑是最常用的化療藥物之一，這兩種藥物對BTSCs的作用及機(jī)制未見報(bào)道，因此本文對其進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞株由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 藥物及試劑 五味子木脂素由吉林醫(yī)藥學(xué)院自制，用干細(xì)胞培養(yǎng)液配制成濃度2 g/L備用，過濾后4℃ 保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用干細(xì)胞培養(yǎng)液(SCM)稀釋至所需濃度。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自美國Sigma公司;RPMI-1640購自美國Hyclone公司，神經(jīng)培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、小牛血清和B27添加物購自美國Gibco公司，人堿性成纖維生長因子(b FGF)和人表皮生長因子(EGF)購自英國Pepro Tech公司，bcl-2和半胱氨酸蛋白酶(caspase 3)抗體購自北京中杉公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人SHG-44細(xì)胞接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2，飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液。待細(xì)胞生長至80% ～90%，將SHG-44細(xì)胞以104/cm2密度接種到75 cm2培養(yǎng)瓶，加入SCM由神經(jīng)培養(yǎng)基、B27添加物、EGF和 b FGF組成，EGF和 b FGF終濃度為20 μg/L，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～5 d換液一次，傳代時(shí)機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液，按1∶2比例傳代，3代以后的神經(jīng)球用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的SHG-44神經(jīng)球懸于SCM中，調(diào)細(xì)胞濃度至3×105/ml，接種于96孔板，每孔100 μl，每組設(shè)5個(gè)平行孔，藥物組分別加入五味子木脂素50、100、200 mg/L和順鉑10 mg/L，空白對照組加入等體積的SCM，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別作用24、48、72 h 取出96 孔板，加入5 μg/ml的 MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h;取出96孔板，每孔加入二甲基亞礬(DSMO)150 μl振蕩20 min，使結(jié)晶完全溶解，自動(dòng)酶標(biāo)儀測定各孔490 nm的吸光度值(A490)。

1.5 神經(jīng)球細(xì)胞分泌bcl-2和caspase 3蛋白測定 取生長狀態(tài)良好的SHG-44神經(jīng)球細(xì)胞，按5×104/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml。藥物組分別加入五味子木脂素(50、100和200 mg/L)和順鉑10 mg/L作用72 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，空白對照組加入SCM。取培養(yǎng)上清包被96孔酶標(biāo)板4℃過液，封閉后加入bcl-2和caspase 3抗體(1∶500稀釋)4℃過夜，次日二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，當(dāng)有顏色變化時(shí)加入終止液。自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm處測定吸光度(A)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件，計(jì)量資料以s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 五味子木脂素和順鉑對SHG-44神經(jīng)球細(xì)胞生長的抑制作用 各濃度組五味子木脂素作用SHG-44神經(jīng)球細(xì)胞24、48、72 h，均能明顯地抑制神經(jīng)球細(xì)胞的生長。與空白對照組比較，24 h時(shí)各濃度組，48和72 h時(shí)100、200 mg/L濃度組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，并且藥物作用具有濃度依賴性。而順鉑作用SHG-44細(xì)胞后，不同時(shí)間均抑制神經(jīng)球細(xì)胞的生長，與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，并且藥物作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。見表1。

2.2 五味子木脂素和順鉑對SHG-44神經(jīng)球分泌bcl-2和caspase 3蛋白的影響 不同濃度組五味子木脂素作用SHG-44神經(jīng)球細(xì)胞72 h后，各用藥組bcl-2蛋白分泌都呈下降趨勢，100、200 mg/L濃度組與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各濃度組caspase 3蛋白水平升高，與對照組相比200 mg/L組有顯著性差異。與對照組比較，順鉑組bcl-2水平明顯下降，而caspase 3水平明顯升高(P＜0.05)。見表2。

表1 五味子木脂素和順鉑對SHG-44神經(jīng)球細(xì)胞生長的抑制作用(n=5，s)

表1 五味子木脂素和順鉑對SHG-44神經(jīng)球細(xì)胞生長的抑制作用(n=5，s)

與對照組比較:1)P＜0.01

OD 值0 0.64±0.02 0.66±0.01 0.71±0.02五味子木脂素組 50 0.56±0.031)0.61±0.02 0.70±0.03 100 0.51±0.041)0.53±0.051)0.62±0.051)200 0.45±0.051)0.50±0.051)0.58±0.051)順鉑組 10 0.54±0.021)0.55±0.041)0.57±0.041)24 h 48 h 72 h對照組組別 藥物濃度(mg/L)

表2 五味子木脂素和順鉑對SHG-44神經(jīng)球分泌bcl-2和caspase 3蛋白的影響(s)

表2 五味子木脂素和順鉑對SHG-44神經(jīng)球分泌bcl-2和caspase 3蛋白的影響(s)

與對照組比較:1)P＜0.05

順鉑組caspase 3 0.27±0.01 0.29±0.01 0.32±0.01 0.35±0.021)0.35±0.021)指標(biāo) 對照組 五味子木脂素組50 mg/L 100 mg/L 200 mg/L bcl-2 0.17±0.04 0.14±0.04 0.11±0.011)0.09±0.011)0.09±0.011)

3 討論

腦腫瘤發(fā)生部位在顱內(nèi)，以膠質(zhì)瘤時(shí)性居多，大多數(shù)為惡性，由于部位的隱匿性，發(fā)現(xiàn)即處于晚期〔4〕。同時(shí)由于腦腫瘤在人體功能中所占的特殊地位，它對生命的威脅更大，對生活質(zhì)量的影響也更明顯。腦腫瘤中存在的“BTSCs”是腦腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)的根源，并使腫瘤對放、化療等產(chǎn)生抵抗〔5〕?，F(xiàn)有的多種化療藥物對 BTSCs治療無效〔6〕，因此，有必要研究針對BTSCs治療有效的藥物。

對五味子的應(yīng)用已有兩千多年的歷史，是著名的滋補(bǔ)中藥之一，是長白山的特色中藥材。因其具有抗衰老、保肝、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種藥用功效，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中五味子被列為上品。最近研究發(fā)現(xiàn)，五味子具有抗腫瘤作用，主要是通過氧化應(yīng)激、促進(jìn)凋亡等多種機(jī)制抑制腫瘤的生長，也可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力增強(qiáng)抗腫瘤作用〔1〕。

本實(shí)驗(yàn)組將人SHG-44細(xì)胞置入SCM中進(jìn)行傳代培養(yǎng)三代以上，獲得具有BTSCs特性的腫瘤細(xì)胞。用不同濃度五味子木脂素和順鉑作用神經(jīng)球細(xì)胞后，MTT結(jié)果顯示，五味子木脂素各濃度組均可明顯抑制神經(jīng)球細(xì)胞的生長，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。而一定濃度的順鉑在各時(shí)間段均可以抑制膠質(zhì)瘤神經(jīng)球細(xì)胞的生長，呈現(xiàn)時(shí)間依賴效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在藥物作用神經(jīng)球后培養(yǎng)上清中bcl-2分泌水平下降，而caspase 3分泌水平升高。

細(xì)胞生長受抑制可能由于多種原因?qū)е?，但以線粒體信號傳導(dǎo)通路中bcl-2蛋白的研究最為活躍〔7〕。bcl-2過表達(dá)可以通過阻斷線粒體膜電位下降和細(xì)胞色素C的釋放，降低對多種化療藥物的敏感性〔8〕，使細(xì)胞繼續(xù)保持生長狀態(tài)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，由于SHG-44神經(jīng)球在五味子木脂素或順鉑作用后，引起抗凋亡因素 bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，分泌減少，引起caspase 3活化，進(jìn)而使細(xì)胞的生長受抑制，但更進(jìn)一步的機(jī)制還有待深入研究。

1 任麗佳，李 林，殷放宙，等.五味子抗腫瘤活性成分及作用機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012;28(1):140-2.

2 Qi L，Bellail AC，Rossi MR，et al.Heterogeneity of primary glioblastoma cells in the expression of caspase-8 and the response to TRAIL-induced apoptosis〔J〕.Apoptosis，2011;16(11):1150-64.

3 金 宏，溫 娜，劉 巍，等.五味子總木脂素對大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012;28(7):613-4.

4 Holland EC.Glioblastoma multiforme:the terminator〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(12):6242-4.

5 Dirks PB.Brain tumor stem cells:the cancer stem cell hypothesis writ large〔J〕.Mol Oncol，2010;4(5):420-30.

6 Eramo A，Ricci-Vitiani L，Zeuner A，et al.Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells〔J〕.Cell Death Differ，2006;13(7):1238-41.

7 李艷鳳，唐麗萍，馬 超，等.白附子提取物抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究〔J〕.中國藥學(xué)雜志，2009;44(16):1237-40.

8 Walczak H，Bouchon A，Stahl H，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand retains its apoptosis inducing capacity on Bcl-2 or Bcl-xL overexpressing chemotherapy-resistant tumor cells〔J〕.Cancer Res，2000;60(11):3051-7.