李英健 趙恩宏 蘇 銳 侯 雷 劉志滿 申興斌 (承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院外三科，河北 承德 067000)

大腸癌在西方國家的發(fā)病率排第二位〔1〕。浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的最重要特性，也是一些實質(zhì)性腫瘤難以治愈的原因?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2因其可以降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤血管形成〔2〕，故在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起到了重要的作用。β-半乳糖苷結(jié)合蛋白(Galectins)屬于凝集素家族，其重要成員之一Galectin-3是MMP-2的底物，因此推測其與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。本試驗研究旨在研究大腸癌組織中MMP-2與Galectin-3的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料 取承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院外三科2011年12月至2012年12月手術(shù)切除的大腸癌標本52例，同時選取距癌組織邊緣大于5 cm處的正常黏膜20例作為對照，另外選取大腸腺瘤標本20例。所有病人均除外:①術(shù)前行放化療者;②其他部位的惡性腫瘤者;③免疫性疾病者。52例大腸癌患者中男性29例，女23例，年齡32～75〔平均(54.23±11.06)〕歲。原發(fā)病灶部位:結(jié)腸20例，直腸32例;分化程度:高分化10例，中分化27例，低分化15例;浸潤未超過肌層組12例，浸潤到肌層或漿膜層組40例;淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移:陰性22例，陽性30例。

1.2 免疫組化 兔抗人MMP-2、Galectin-3多克隆抗體購自北京中杉金橋公司，免疫組化MaxVision試劑盒羊抗鼠/兔購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。石蠟切片3 μm，脫蠟至水。3%過氧化氫室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，微波爐加熱0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)至沸騰后將上述組織切片放入，抗原熱修復(fù)15 min，室溫放置4 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加Ⅰ抗50 μl(MMP-2 1∶80 工作液;Galectin-3 1∶80 工作液)，4℃冰箱過夜。PBS沖洗3次，每次5 min。滴加Ⅱ抗(快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物)，室溫孵育15 min。PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色5 min，終止顯色，蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染，透明、封片、鏡檢。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷 MMP-2與Galectin-3主要定位于細胞質(zhì)，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色細胞。采用陽性染色強度結(jié)合陽性細胞所占百分比進行判斷。在400倍視野下，每張切片隨機觀察4個視野，將切片中平均陽性比例及染色深淺分別計0～3分，切片中無陽性細胞0分，陽性細胞＜25%計1分，25% ～75%計2分，＞75%計3分;染色強度以多數(shù)細胞為準;無著色計0分，淡黃色計1分，黃或深黃色計2分，褐或棕褐色計3分，再按這兩項指標的積分相加將結(jié)果分為4級:0分為“－”，1～2分為“+”，3～4分為“?”，5～6分為“?”，其中“+”為弱陽性，“?”為中等陽性，“?”為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS13.0進行秩和檢驗和Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2與Galectin-3在大腸正常黏膜、大腸腺瘤和大腸癌中的表達 MMP-2與Galectin-3在大腸正常黏膜、大腸腺瘤和大腸癌中均有陽性表達，且二者的表達強度均依次增加，三組之間陽性表達率差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(表1)。

2.2 大腸癌中MMP-2與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 MMP-2在浸潤程度深的大腸癌組織的表達明顯高于浸潤程度淺的(P＜0.01);MMP-2在低分化大腸癌中的表達高于高分化和中等分化的(P＜0.01);MMP-2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(P＜0.05)。MMP-2在不同性別、年齡(≤60歲，＞60歲)及腫瘤發(fā)生部位的表達則無明顯差異(P＞0.05)(表2)。

2.3 大腸癌中Galectin-3與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Galectin-3在浸潤程度深的大腸癌組織的表達明顯高于浸潤程度淺的(P＜0.01);Galectin-3在低分化大腸癌中的表達則高于高分化和中等分化的(P＜0.05);Galectin-3有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(P＜0.01)。Galectin-3在不同性別、年齡(≤60，＞60)及腫瘤發(fā)生部位的表達則無明顯差異(P＞0.05)(表2)。

2.4 MMP-2與Galectin-3在大腸癌表達的相關(guān)性分析 MMP-2與Galectin-3呈正相關(guān)(r=0.876，P＜0.01)。

表1 MMP-2與Galectin-3在各種組織中的表達(n)

表2 MMP-2與Galectin-3在不同臨床病理參數(shù)的大腸癌中的表達(n)

3 討論

腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤致死的主要原因，腫瘤組織及其間質(zhì)的基底膜是腫瘤細胞浸潤和擴散過程中的天然屏障，組織學上，基底膜的完整性破壞被認為是惡性腫瘤侵襲的開始。正常的基底膜主要由Ⅳ型膠原構(gòu)成，MMP-2作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員之一，又稱為Ⅳ型膠原酶，可以降解Ⅳ、Ⅴ型膠原和層黏連蛋白，從而破壞基底膜的完整性。很多研究表明，MMP-2能夠影響患者免疫反應(yīng)和腫瘤血管形成，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移〔3〕，因此MMP-2在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到了重要的作用。

Lemieux等〔4〕MMP-2在大腸癌患者中表現(xiàn)為高表達，而且與大腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Reed等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)MMP-2的高表達與前列腺腫瘤血管形成密切相關(guān)，而且MMP-2為腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移提供了適宜的環(huán)境。Guo等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達與肺癌遠處轉(zhuǎn)移、組織學分型及腫瘤的低分化等密切相關(guān)。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，說明MMP-2的表達與大腸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，而且提示了MMP-2與大腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性。

Galectin-3是MMP-2的底物〔7〕，目前已經(jīng)明確MMP-2表達增高與腫瘤演進有關(guān)，這樣裂解的Galectin-3可能在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中起到一定的作用，加之Galectin-3具有糖親和性〔8〕、參與炎癥細胞的游走〔9〕及阻止細胞凋亡〔10〕，因此腫瘤細胞表面Galectin-3的表達增高可以通過增加細胞聚集和提高于內(nèi)皮細胞的親和性增大了腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能。

Shankar等〔11〕應(yīng)用免疫組化法檢測了Galectin-3在甲狀腺樣本中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Galectin-3在甲狀腺癌腫的表達明顯高于在良性甲狀腺病變中的表達，但在正常的甲狀腺組織中不表達。Miyazaki等〔12〕通過對86例胃癌標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)Galectin-3的表達陽性率為84%，其在癌組織中的表達較癌旁組織明顯增高。周瑜琪等〔13〕應(yīng)用組織芯片和免疫組織化學法檢測174例子宮頸癌患者的Galectin-3的表達情況，發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，特別是盆腔淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移與Galectin-3的高表達密切相關(guān)。這些研究結(jié)果均與本研究結(jié)果一致，這表明隨著腫瘤的進展，Galectin-3的表達增強，而且Galectin-3的高表達，與影響大腸癌預(yù)后的重要因素腫瘤侵襲能力、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等之間存在相關(guān)性。

1 Jemal A，Thomas A，Murray T，et al.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2013;63(1):11-30.

2 Ola M，Omran A，Mostafa T，et al.Gelatinases A and B expression in human colorectal cancer in upper egypt:a clinicopathological study〔J〕.Ultrastruct Patho，2012;36(2):108-16.

3 Michael G，Charlotte K，Susanne S，et al.Distinct functionality of tumor cell-Derived gelatinases during formation of liver metastases〔J〕.Mol Cancer Res，2008;6(3):341-51.

4 Lemieux E，Bergeron S，Durand V，et al.Constitutively active MEK1 is sufficient to induce epithelial to mesenchymal transition in intestinal epithelial cells and to promote tumor invasion and metastasis〔J〕.Int Cancer，2009;125(7):1575-86.

5 Reed MJ，Karres N，Eyman D，et al.The effects of aging on tumor growth and angiogenesis are tumor cell dependent〔J〕.Int J Cancer，2007;120(4):753-60.

6 Guo CB，Wang S，Deng C，et al.Relationship between matrix metalloproteinase-2 and lung cancer progression〔J〕.Mol Diagn Ther，2007;11(3):183-92.

7 Nangia-Makker P，Raz T，et al.Galectin-3 cleavage:a novel surrogate marker for matrix metalloproteinase activity in growing breast cancers〔J〕.Cancer Res，2007;67(24):11760-8.

8 Nangia-Makker P，Honjo Y，Sarvis R，et al.Galectin-3 induces endothelial cell morphogenesis and angiogenesis〔J〕.Am J Pathol，2000;156(3):899-909.

9 Glinsky VV，Glinsky GV，Rittenhouse-Olson K，et al.The role of Thomsen-Friedenreich antige in adhesion of human breast and prostate cancer cells to the endothelium〔J〕.Cancer Res，2001;61(12):4851-7.

10 Vasta GR.Roles of galectins in infection〔J〕.Nat Rev Microbiol，2009;7(6):424-38.

11 Shankar J，Wiseman SM，Meng F，et al.Coordinated expression of galectin-3 and caveolin-1 in thyroid cancer〔J〕.J Pathol，2012;228(1):56-6.

12 Miyazaki J，Hokari R，Kato S，et al.Increased expression of Galectin-3 in primary gastric cancer and the metastatic lymph nodes〔J〕.Oncol Rep，2002;9(6):1307-12.

13 周瑜琪，周學科，孔蘊毅，等.半乳糖凝集素-3在宮頸癌中的表達及其臨床意義〔J〕.腫瘤，2011;31(2):148-53.