周 憲 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，重慶 400030)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)老年患者因發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已是晚期〔1〕，已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，因此放化療成為其主要治療手段。而一般認(rèn)為腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力與輻射敏感性密切相關(guān)。本文采用限制性長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)研究ERCC1 rs3212986 SNP與NSCLC老年患者放療療效的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年1月至2013年1月老年NSCLC患者采用三維適形放療或常規(guī)放療44例，男32例，女12例，年齡65～83歲，平均(71.2±4.3)歲;均為初次治療?？ㄊ显u(píng)分≥80分32例，70～80分12例，病理類(lèi)型:腺癌10例，鱗癌27例，腺鱗癌2例;未能分類(lèi)2例，分化差的癌3例;T分期T1 3例，T2 18例，T3 10例，T4 13例;N分期:N1 2例，N2 22例，N3 20例。UICC分期:Ⅲa 19例，Ⅲb 25例;放療方案:三維適形26例;常規(guī)放療18例。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)細(xì)胞學(xué)或病理證實(shí)為NSCLC的患者;全部為住院治療患者;卡氏評(píng)分＞70分;2002年UICCTNM分期為Ⅲ期;年齡60歲以上;無(wú)明顯心、肺、肝、腎功能異常;預(yù)計(jì)生存期3個(gè)月?；颊吆炇鹬橥鈺?shū)后入組。

1.3 治療方法 常規(guī)分割治療18例，三維適形放療26例。常規(guī)放療患者仰臥于模擬機(jī)床，平靜呼吸，透視下所見(jiàn)腫瘤邊緣外放1～2 cm作為靶區(qū)，照射范圍包括原發(fā)病灶、同側(cè)縱隔和肺門(mén)，病灶位于上葉則照射野上界達(dá)隆突下3～5 cm，病灶位于下葉則下界達(dá)膈面。前后對(duì)穿野照射總量40 Gy后避開(kāi)脊髓角度野照射，若鎖骨上出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則加照鎖骨上野。照射劑量為1.90～1.95 Gy/次，5次/w，總劑量為66～70 Gy，6～7 w完成。三維適形放療患者仰臥于三維立體定位框架床，雙臂上抬抱頭，真空負(fù)壓袋和熱塑體膜固定，平靜呼吸狀態(tài)下行胸部CT模擬定位和CT掃描，掃面范圍從胸廓入口至肋膈角水平，掃描層厚為0.5 cm，全部病例均做增強(qiáng)掃描。將CT影像資料轉(zhuǎn)到三維治療計(jì)劃系統(tǒng)。根據(jù)ICRU50號(hào)文件標(biāo)準(zhǔn)定義規(guī)定勾畫(huà)放療靶區(qū)，由放射診斷和放射治療科醫(yī)師共同勾畫(huà)大體腫瘤體積(GTV)，包括原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，放射靶區(qū)(CTV)的邊界為CT肺窗條件下GTV外1 cm(不包括預(yù)防照射淋巴結(jié)引流區(qū))，CTV外放5 mm為計(jì)劃靶體積(PTV)。利用射野方向觀(BEV)進(jìn)行照射野設(shè)計(jì)，以PTV中心為射野等中心，通過(guò)劑量體積直方圖(DVH)進(jìn)行治療計(jì)劃優(yōu)化，一般采用4～6個(gè)共面射線束，靶區(qū)劑量采用90%的等劑量曲線腫瘤劑量為200 Gy/次，5次/w的常規(guī)分割，總劑量66 Gy。同時(shí)保證肺V20≤25%，脊髓≤40 Gy，食管≤50 Gy。

1.4 療效觀察及毒性評(píng)定 治療1～3個(gè)月，近期療效按WHO制定的實(shí)體瘤近期療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、無(wú)變化(NC)和進(jìn)展(PD)。放療毒副作用按照美國(guó)腫瘤放射治療協(xié)作組(RTOG)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為0～4級(jí)。

1.5 人切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(ERCC1)分析 取患者抗凝外周血樣本100 μl，用磁珠法提取DNA。操作流程參照MzgaZorb DNA微量提取試劑盒(BioFlux公司產(chǎn)品)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCRRFLP基因分型引物采用PIRA-PCR在線工具及primer premier軟件設(shè)計(jì)。正義:5'-CCGGAGGCTGTTTGATGT，反義:CAGTGCCCCAAGAGGAGAT，PCR 產(chǎn)物 332 bp，酶切產(chǎn)物 CC:332 bp，AA:239/93 bp，CA:332/239/93 bp。見(jiàn)表2。PCR條件為95℃預(yù)變性 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。酶切反應(yīng)為15 μl體系，包括12 μl PCR產(chǎn)物，1×酶切反應(yīng)緩沖液和3 U MboⅡ內(nèi)切酶。37℃水浴3 h，3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，判斷基因型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，kaplanmeier生存分析及l(fā)ogrank分析。

2 結(jié)果

2.1 ERCC1 rs3212986多態(tài)位點(diǎn)與放療敏感性分析 ERCC1 rs3212986多態(tài)位點(diǎn)CC、CA和AA三種基因型中，放療敏感性(CR和PR)和不敏感(NC和PD)患者的分布比分別是6例(30%)和14例(70%)、7例(36.8%)和 12例(63.2%)、3例(60%)和2例(40%)，顯著改善放療患者療效的AA基因型。與CC基因型患者比較，CA和AA基因型患者對(duì)放療更敏感，近期療效更好。攜帶CA基因型患者和攜帶AA基因型患者放療更加敏感，OR值分別達(dá)到1.31(95%CI=0.59～2.62，P=0.542)和5.63(95%CI=1.01-20.37，P=0.028)。研究發(fā)現(xiàn)，隨著A等位基因數(shù)量的增加，患者放療的療效逐漸變好，放療敏感性逐漸增加，患者對(duì)放射治療敏感程度的增加與其攜帶A等位基因數(shù)目的增加保持一致。攜帶AA基因型患者是三種基因型中放療最敏感、近期療效最好的患者，敏感程度是不攜帶A等位基因(CC基因型)患者的2.46倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)。而攜帶一個(gè)A等位基因的患者其放療敏感性是不攜帶A等位基因患者的1.46倍(95%CI=0.81～2.57，P=0.185)。此外，常規(guī)放療與適形放療患者不同基因型之間的療效比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.502、0.495)。

2.2 各臨床因素和NSCLC放療結(jié)局的危險(xiǎn)度評(píng)價(jià) 性別、年齡、病理、治療方法等因素對(duì)治療結(jié)局無(wú)明顯影響(均P＞0.05);基因型、分期對(duì)治療結(jié)局有明顯影響(P＜0.05)。患者ERCC1 rs3212986 SNP對(duì)放療毒副作用無(wú)明顯影響(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各臨床因素和NSCLC放療結(jié)局的危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)

3 討論

臨床上觀察到同樣的病例給予同樣的放療方案，患者的放療反應(yīng)和最終療效也有一定的差異。若能找到能預(yù)測(cè)放療敏感性的生物標(biāo)志物，就可能設(shè)計(jì)出個(gè)體化的放療方案，提高療效并減少不必要的放療反應(yīng)。

研究表明，電離輻射可造成DNA結(jié)構(gòu)和功能損傷，而DNA損傷修復(fù)過(guò)程中許多基因起著不同的重要作用，這些基因的SNPs可改變蛋白質(zhì)表達(dá)水平或功能，進(jìn)而改變DNA修復(fù)能力，這為檢測(cè)此類(lèi)基因的SNPs來(lái)預(yù)測(cè)放療敏感性提供了思路。

近年來(lái)隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)ERCC1的表達(dá)水平和放療療效及預(yù)后密切相關(guān)。回顧迄今國(guó)內(nèi)外針對(duì)耐藥基因與放療進(jìn)行的許多研究及臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ERCC1過(guò)表達(dá)者易獲得較差療效，而ERCC1的表達(dá)往往與其SNP相關(guān)〔1〕。

ERCC1基因編碼的蛋白在核苷酸切除修復(fù)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，也參與了如紫外線或者順鉑類(lèi)親電子復(fù)合物所造成的DNA損傷修復(fù)過(guò)程〔1〕。ERCC1可催化DNA重組修復(fù)和鏈間交聯(lián)修復(fù)。ERCC1蛋白突變或者表達(dá)量的變化都有可能影響細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力。

近年來(lái)的研究表明，ERCC1 rs3212986位點(diǎn)SNP與直腸癌患者接受新輔助放化療療效相關(guān)，并且該位點(diǎn)攜帶不同基因型的患者ERCC1蛋白表達(dá)水平不相同。ERCC1蛋白的表達(dá)水平與接受鉑類(lèi)藥物治療患者的藥物抵制及放療療效相關(guān)聯(lián)〔2〕。研究分析了術(shù)后放療的NSCLC患者ERCC1 SNP與正常組織放療敏感性相關(guān)，發(fā)現(xiàn)ERCC1 rs3212986位點(diǎn)SNP與放療導(dǎo)致毛細(xì)血管擴(kuò)張癥和皮下纖維化的發(fā)生密切相關(guān)〔3〕。

研究分析發(fā)現(xiàn)ERCC1 SNP或低表達(dá)患者中使用個(gè)體化治療獲得更高的有效率，但并未發(fā)現(xiàn)能延長(zhǎng)疾病無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期〔4〕。

目前研究主要集中于DNA修復(fù)基因SNP位點(diǎn)與腫瘤易感性的相關(guān)，而其預(yù)測(cè)癌癥療效的研究才剛剛起步〔5〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述SNP差異與放療療效相關(guān)，該位點(diǎn)不同基因型NSCLC老年患者放療的近期療效不同。攜帶CA基因型患者和攜帶AA基因型患者放療更加敏感，隨著A等位基因數(shù)量的增加，患者放療的療效逐漸變好。原因可能是該位點(diǎn)SNP的變化導(dǎo)致ERCC1表達(dá)量出現(xiàn)變化，進(jìn)而影響DNA損傷后修復(fù)功能。

1 Sakano S，Ogawa S，Yamamoto Y，et al.ERCC1 and XRCC1 expression predicts survival in bladder cancer patients receiving combined trimodality therapy〔J〕.Mol Clin Oncol，2013;1(3):403-10.

2 Páez D，Salazar J，Paré L，et al.Pharmacogenetic study in rectal cancer patients treated with preoperative chemradiotherapy:polymorphisms in thymidylate synthase，epidermal growth factor receptor，GSTP1，and DNA repair genes〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2011;81(5):1319-27.

3 Gandara DR，Grimminger P，Mack PC，et al.Association of epidermal growth factor receptor activating mutations with low ERCC1 gene expression in non-small cell lung cancer〔J〕.J Thorac Oncol，2010;5(12):1933-8.

4 Mountzios G，Vitae，Dimopoulos MA，et al.Histopathologic and genetic alterations as predictors of response to treatment and survival in lung cancer:a review of published data〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol，2010;75(2):94-109.

5 Roth JA，Carlson JJ.Prognostic role of ERCC1 in advanced non-smallcell lung cancer:a systematic review and meta-Analysis〔J〕.Clin Lung Cancer，2011;12(6):393-401.