李文媛 王 瑩 劉艷翠 尹國(guó)華 馮克儉 (牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江 牡丹江 570)

癌細(xì)胞經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移是直腸癌最重要的轉(zhuǎn)移方式和影響預(yù)后的最主要因素之一〔1〕，因而研究直腸癌淋巴管生成和轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要的臨床價(jià)值。膠原和鈣結(jié)合EGF域1(Ccbe1)是Hogan等〔2，3〕報(bào)道的一種新發(fā)現(xiàn)的淋巴管生成因子，在人類(lèi)和斑馬魚(yú)的淋巴管發(fā)育和生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑及遷移的功能〔4〕，其表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和存活。迄今為止，Ccbe1參與調(diào)控淋巴管生成的具體機(jī)制尚未清楚。本研究探討直腸癌中Ccbe1的表達(dá)及其與淋巴管密度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和直腸癌預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取牡丹江市腫瘤醫(yī)院2007年12月至2010年5月原發(fā)直腸癌患者45例。女17例，男28例，年齡≥60歲26例;＜60歲19例。按世界衛(wèi)生組織(WHO)病理分型標(biāo)準(zhǔn):高分化27例，中分化15例，低分化3例。Dukes A期5例、B期7例、C期21例、D期12例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。對(duì)照組20例，均為直腸息肉手術(shù)切除病例。隨訪至2011年6月20日，隨訪時(shí)間為4～60個(gè)月，平均36個(gè)月。

1.2 主要試劑 Ccbe1抗體和LYVE-1抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Trizol試劑、SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs購(gòu)自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶、DL2000DNA標(biāo)志物購(gòu)自Takara公司，Ccbe1和β-actin引物由大連寶生物合成。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說(shuō)明的步驟進(jìn)行，其中一抗?jié)舛菴cbe1(1∶100)、LYVE-1(1∶200)。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按照細(xì)胞著色強(qiáng)度(無(wú)0分;弱1分;中2分;強(qiáng)3分)和切片中陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分(≤5%，0分;6% ～0%，1分;11% ～20%，2分;21% ～50%，3分;＞50%，4分)之和為該病例評(píng)分值，將評(píng)分值≤2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。LVD定量分析:先在低倍鏡下選擇淋巴管最豐富區(qū)域，在高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野淋巴管數(shù)，取其均值作為該切片淋巴管數(shù)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 總RNA提取，采用Zacharek等〔5〕報(bào)道方法進(jìn)行PCR反轉(zhuǎn)錄、檢測(cè)及熒光定量分析。引物設(shè)計(jì)及合成按照已報(bào)道的序列設(shè)計(jì)并合成Ccbe1以及內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白β-actin的特異性引物。各引物的序列為:Ccbe1:上游5’-CTTGGGAAGGCAAGACTCAC-3’，下游5’-AGCCCCTGAT-GAAGGAGTTT-3’;β-actin:上游 5-TGAAGGTCGGTGTCAACGGA-3，下游5-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3。分析方法采用2-△△CT方法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、LSD法和Kaplan-Meier生存分析。

2 結(jié)果

2.1 Ccbe1的表達(dá)情況 Ccbe1陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜內(nèi)，呈棕黃色顆粒狀，陰性細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜不著色。Ccbe1在直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為68.8%，明顯高于直腸息肉組中陽(yáng)性表達(dá)率(25.0%)(χ2=10.794，P ＜0.01)。

2.2 Ccbe1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 在各種臨床因素中，Ccbe1蛋白表達(dá)與Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.01)，而與年齡、性別及腫瘤分化程度各組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Ccbe1在直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(n)

2.3 Ccbe1表達(dá)與LVD的關(guān)系 LYVE-1特異性地表達(dá)在直腸癌組織中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕色管腔。Ccbe1陽(yáng)性組LVD(14.65±0.84)顯著高于陰性組(10.10±0.52)(t=9.145，P＜0.01)。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增效率檢測(cè) 直腸癌組織中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(0.104±0.011)和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(0.067±0.006)Ccbe1 mRNA的相對(duì)表達(dá)較聲帶息肉組(0.041±0.002)明顯增加(P=0.000)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中Ccbe1 mRNA表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(F=68.286，P＜0.01)。

2.5 生存率分析 Ccbe1陽(yáng)性組平均生存時(shí)間〔(44.41±5.61)個(gè)月〕，明顯低于陰性組〔(61.70±4.81)個(gè)月〕，Log rank檢驗(yàn)表明Ccbe1陽(yáng)性表達(dá)與生存曲線負(fù)相關(guān)(χ2=4.059，P＜0.05)。

3 討論

約40%的直腸癌病例確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而淋巴管轉(zhuǎn)移是直腸癌主要轉(zhuǎn)移方式〔1〕。最近發(fā)現(xiàn)的癌基因Ccbe1一種分子量為44 kD的蛋白，這種蛋白包含許多可供識(shí)別的結(jié)構(gòu)單位，包括可結(jié)合一個(gè)天冬氨酸/天冬酰胺羥基化位置的EGF樣區(qū)域，此區(qū)域具有細(xì)胞活力相關(guān)蛋白的重要特征〔2〕。目前關(guān)于Ccbe1對(duì)腫瘤的作用尚不明確，有研究〔4，6〕發(fā)現(xiàn) Ccbe1基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑及遷移的功能，其表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和存活。但有研究〔7〕發(fā)現(xiàn)Ccbe1在卵巢癌細(xì)胞株和卵巢原發(fā)癌中顯著下調(diào)，并與卵巢癌的腫瘤分化、腫瘤分級(jí)和低存活率負(fù)相關(guān)。本研究推測(cè)Ccbe1能夠促進(jìn)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究還提示檢測(cè)直腸癌患者Ccbe1的表達(dá)將有望成為判斷直腸癌預(yù)后的新指標(biāo)。

Hogan等〔2〕發(fā)現(xiàn)Ccbe1是淋巴管萌芽和淋巴管靜脈內(nèi)皮細(xì)胞從主靜脈遷移的關(guān)鍵因素，沉默Ccbe1基因可致淋巴管不能從原始的靜脈發(fā)芽并形成脊索旁淋巴前體，導(dǎo)致斑馬魚(yú)淋巴管發(fā)育受阻并引起水腫，而Alders等〔3〕對(duì)人類(lèi) Hennekam淋巴管擴(kuò)張癥研究也證實(shí)了這一結(jié)果。在本試驗(yàn)中直腸癌組織中Ccbe1表達(dá)與淋巴管密度密切相關(guān)，證實(shí)了Ccbe1能夠促進(jìn)直腸癌淋巴管生成，我們推測(cè)其機(jī)制可能與Ccbe1能夠顯著地增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)淋巴管生成表達(dá)有關(guān)〔8〕，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究和證實(shí)。

綜上，Ccbe1能夠促進(jìn)直腸癌淋巴管生成和淋巴管轉(zhuǎn)移，Ccbe1的檢測(cè)將有望成為判斷直腸癌患者預(yù)后的一個(gè)新指標(biāo)。

1 黃景山.老年直腸癌患者188例預(yù)后因素分析〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;9(31):3260-2.

2 Hogan BM，Bos L，Bussmann J，et al.Ccbe1 is required for embryonic lymphangiogenesis and venous sprouting〔J〕.Nature Genet，2009;41(4):396-8.

3 Alders M，Hogan BM，Gjini E，et al.Mutations in CCBE1 cause generalized lymph vessel dysplasia in humans〔J〕.Nature Genet，2009;41(12):1272-4.

4 Barton CA，Gloss BS，Qu W，et al.Collagen and calcium-binding EGF domains 1 are frequently inactivated in ovarian cancer by aberrant promoter hypermethylation and modulates cell migration and survival〔J〕.Br J Cancer，2010;102(1):87-96.

5 Zacharek A，Chen J，Cui X，et al.Angiopoietin1/Tie2 and VEGF/Flk1 induced by MSC treatment amplifies angiogenesis and vascular stabilization after stroke〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2007;27(3):1684-91.

6 王 瑩，李文媛，張大偉，等.Ccbe1在喉癌中的表達(dá)及其臨床意義.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012;43(1):58-61.

7 Hauptmann S，Denkert C，Koch I，et al.Genetic alterations in epithelial ovarian tumors analyzed by comparative genomic hybridization〔J〕.Hum Pathol，2002;33(6):632-41.

8 Bos FL，Caunt M，Peterson J，et al.CCBE1 is essential for mammalian lymphatic vascular development and enhances the lymphangiogenic effect of vascular endothelial growth factor-C in vivo〔J〕.Circ Res，2011;109(5):486-91.