牛 彤 楊志平 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132001)

食管癌是發(fā)生在食管黏膜上皮組織的腫瘤，是一類(lèi)嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的高致死性腫瘤。食管癌患者的預(yù)后較差，所以早期診斷、早期預(yù)防顯得尤為重要。微RNA(miRNA)是一類(lèi)在生物體內(nèi)普遍存在的單鏈非編碼蛋白質(zhì)小分子RNA，研究表明它們可以特異性識(shí)別靶基因mRNA的3'UTR并與之結(jié)合，引起靶mRNAs發(fā)生降解或翻譯受到抑制〔1，2〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA具有廣泛的生物學(xué)功能，其通過(guò)對(duì)細(xì)胞中與增殖、分化、凋亡等相關(guān)基因的調(diào)控，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程〔3，4〕。本研究通過(guò)構(gòu)建miR-203表達(dá)載體，進(jìn)而觀察其對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，旨在為食管癌的診斷和治療提供新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5和Top10感受態(tài)購(gòu)自TIANGEN公司;轉(zhuǎn)化用大腸桿菌stable3感受態(tài)細(xì)胞初次購(gòu)自Invitrogen公司;質(zhì)粒 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體購(gòu)自 Invitrogen公司;引物合成及基因測(cè)序由上海生物工程有限公司和上海英駿生物技術(shù)公司完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、LipofectAMINE2000 Reagent均購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 檢測(cè)試劑 Total RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)購(gòu)自Qiagen公司;ImProm-ⅡTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;Taq PCR酶購(gòu)于New England BioLabs公司;Oligo dT、Random Primer、dNTP購(gòu)自上海生工有限公司;DNA Loading Buffer等購(gòu)自日本TaKaRa公司;瓊脂糖膠粉購(gòu)自BIOWEST;Ⅰ型鼠尾膠原蛋白購(gòu)自勝友公司;Realtime PCR所用的試劑為BrilliantⅡSYBR Green QPCR Master mix(stratagene)。Total RNA提取試劑盒mirVanaTMmiRNA Isolation Kit，和RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;miRNA定量檢測(cè)試劑盒為NCodeTMmiRNA First-StrandcDNA Synthesis and qRT-PCR Kits;限制性內(nèi)切酶MscⅠ、BfuAⅠ、SacⅠ、XhoⅠ、Taq 酶、T4DNA 連接酶等均購(gòu)自NEB公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)所用的支架購(gòu)于Corning公司，matrigel購(gòu)于BD公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管鱗癌細(xì)胞系(EC-109)由中國(guó)疾病控制中心病毒病研究所周玲研究院提供。將細(xì)胞按105/cm2種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入RPMI 1640(含 10%FBS、2 mmol/L L-Gln、100 U/ml SP)抗生素培養(yǎng)，37℃ CO2孵箱培養(yǎng)。每3天更換新鮮培養(yǎng)基1次。細(xì)胞鋪滿瓶底后用胰蛋白酶消化液消化，按 1∶4傳代、擴(kuò)增。

1.4.2 載體構(gòu)建 按照miRNA設(shè)計(jì)原則，合成兩條單鏈miRNA，Hsa-miR-203雙鏈的設(shè)計(jì)如下:正義:5'-TGCTGTTAATATCGGACAACCATTGTGTTTTGGCCACTGACTGACACAATGGTTCCGATATTAA-3';反義:5'-CCTGTTAATATCGGAACCATTGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACAATGGTTGTCCGATAT-TAAC-3'，分別進(jìn)行雙鏈退火與連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取(步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。將提取的質(zhì)粒用MSCⅠ進(jìn)行酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果;將經(jīng)酶切初步鑒定的陽(yáng)性克隆送至Invitrogen公司進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒按照QIAGEN Plasmid Midi Purification Kit的操作說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)粒的中提。

1.4.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參照說(shuō)明書(shū)。

1.4.4 real-time PCR檢測(cè) 參照說(shuō)明書(shū)。

1.4.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用MTT法檢測(cè)。

1.4.6 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 六孔板中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿板底，橫線劃痕PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按 0、6、12、24 h取樣，拍照。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力的變化。具體操作如下:將小室放入培養(yǎng)板中，上室加入300 μl預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15～30 min，使基質(zhì)膠再水化，再吸去剩余培養(yǎng)液;制備血清饑餓細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液100～200 μl加入transwell小室，向24孔板下室加入500 μl含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)36 h，棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 MiR-203成功克隆到表達(dá)載體中并進(jìn)行酶切鑒定 鑒定圖見(jiàn)圖1。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 轉(zhuǎn)染miRNA前細(xì)胞的形態(tài)和轉(zhuǎn)染miRNA后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。轉(zhuǎn)染miR-203后細(xì)胞的形態(tài)由原來(lái)的球形向纖維樣發(fā)生變化。見(jiàn)圖2。

2.3 細(xì)胞增殖結(jié)果 通過(guò)blasticidin篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-203的EC-109細(xì)胞。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA的細(xì)胞高表達(dá)miR-203轉(zhuǎn)染miR-203后細(xì)胞的增殖情況的變化見(jiàn)圖3。

2.4 miR-203抑制腫瘤的形成 與對(duì)照組相比外源性的miR-203可以有效地降低EC-109細(xì)胞的遷移，降低率為32.4%。進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-203對(duì)EC-109細(xì)胞侵襲能力的作用，與對(duì)照組相比，在高表達(dá)miR-203的實(shí)驗(yàn)組中，miR-203可以抑制EC-109細(xì)胞76.8%的侵襲能力，見(jiàn)圖4，圖5。

圖1 miR-203克隆的電泳酶切鑒定

圖2 轉(zhuǎn)染miR-203后細(xì)胞形態(tài)的變化

圖3 轉(zhuǎn)染miR-203后，EC-109細(xì)胞周期減慢

圖4 miR-203抑制腫瘤細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn)

圖5 miR-203抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)

3 討論

在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，原癌基因和抑癌基因的表達(dá)失調(diào)被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因。最近的研究表明miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要的調(diào)控作用。miRNA可以結(jié)合到靶基因的3’UTR區(qū)域來(lái)清除靶基因mRNA或抑制靶基因的表達(dá)。通過(guò)芯片分析結(jié)果顯示異常表達(dá)的miRNA可以作為腫瘤的識(shí)別標(biāo)志，大量證據(jù)顯示miRNA的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系〔1〕。至今為止只有少數(shù)的miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能被認(rèn)定。

MiR-203的表達(dá)下調(diào)與很多腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系，其中與食道癌的發(fā)生密切相關(guān)，有報(bào)道證實(shí)有幾個(gè)與食道癌相關(guān)的基因被認(rèn)定為miR-203的靶基因。本研究的目的是分析miR-203在食道癌中的生物學(xué)意義。本研究中證實(shí)miR-203的異常高表達(dá)明顯的抑制食道癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并且可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-203對(duì)食道癌的發(fā)病中起到抑制作用，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 Zhang H，Li Y，Lai M.The microRNA network and tumor metastasis〔J〕.Oncogene，2010;29(7):937-48.

2 Ocana OH，Nieto MA.A new regulatory loop in cancer-cell invasion〔J〕.EMBO Rep，2008;9(6):521-2.

3 Santarpial L，Nicoloso M，Calin GA.MicroRNAs:a complex regulatory network drives the acquisition of malignant cell phenotype〔J〕.Endocrelat Cancer，2010;17(1):F51-75.

4 Voorhoeve PM.MicroRNAs:Oncogenes，tumor suppressors or master regulators of cancer heterogeneity〔J〕.Biochim Biophys Acta，2010;1805(1):72-86.