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程樹杰 (河北大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，河北 保定 071000)

Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAP)中最有特點(diǎn)的一員，分子量最小，凋亡抑制作用最強(qiáng)。其氨基端只有一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含的一些氨基酸殘基Tip67、Pro33、Cys84發(fā)揮凋亡抑制作用;羧基末端由一個(gè)兩性α螺旋構(gòu)成，調(diào)節(jié)Survivin的定位分布。研究表明Survivin在人的胚胎、胸腺、生殖腺、甲狀腺、神經(jīng)干細(xì)胞、結(jié)腸上皮細(xì)胞等正常組織少量存在;在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，在人類正常分化的組織中不表達(dá)〔1～4〕。RNA干擾技術(shù)(RNAi)通過雙鏈RNA(dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)其同源特異性mRNA表達(dá)受抑制，從而引起基因轉(zhuǎn)錄后沉默〔5〕。通過RNAi技術(shù)，可以抑制含有特定序列的基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菢?gòu)建Survivin-siRNA重組腺病毒質(zhì)粒，記默Survivin基因，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎293T細(xì)胞ATCC細(xì)胞(上海拜立生物科技有限公司)，培養(yǎng)基 DMEM、0.25%胰酶、PBS、無血清培養(yǎng)基(北京清大天一科技有限公司)，腺病毒載體系A(chǔ)denovirus Dual Expression Kit(pBAsi-Hh1，pBAsi-HU6，pBAsi-Mu6)，轉(zhuǎn)染試劑盒及回收試劑盒，BamH I、EcoR I，QDL2000 Quantitative DNA Marker等(大連寶生物工程有限公司)，瓊脂糖、LB肉湯培養(yǎng)基、甘油、液氮、SOC、卡那霉素、CsCl、病毒裂解上清液礦物等(北京世紀(jì)奧利生物技術(shù)有限公司)。

儀器:恒溫?fù)u床(上海和呈儀器制造有限公司);分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器廠)、恒溫水浴鍋(上海百典儀器設(shè)備有限公司)、低溫高速離心機(jī)(湖南湘立科技儀器有限公司)、孵箱(Thermo上海米力光國(guó)際貿(mào)易有限公司);-80℃冰箱(海爾，北京天地精儀科技有限公司);EP管、方瓶、96孔板、透析袋等(北京清大天一科技有限公司)

1.2 方法

1.2.1 載體的構(gòu)建 靶向Survivin基因寡核苷酸的設(shè)計(jì):參考Reynolds設(shè)計(jì)原則制定shRNA的設(shè)計(jì)策略，選擇Survivin基因(基因序號(hào)為 NM_001168.2)，Survivin-shRNA的有效序列 :GGCTGGCTTCATCCACTGC(86～104)，上游引物序列:5'-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3';下游引物序列5'-TTATTCCCAT-GCGACGGTATC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為186 bp，重組載體命名為pBAsisurvivin。設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為19 nt，寡核苷酸序列以正反向組合，中間添加含9個(gè)寡鏈核苷酸(TTCAAGAGA)的loop結(jié)構(gòu)，使寡核苷酸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，兩端分別帶BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，具體結(jié)構(gòu)為BamH I酶切位點(diǎn)+正義鏈+發(fā)夾結(jié)構(gòu)+反義鏈+終止信號(hào)TTTTTT+EcoR I酶切位點(diǎn)。合成靶序列的oligo DNA由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。重組合成DNA序列:正義鏈: 5'-GATCCGGCTGGCTTCATCCACTGCTTCAAGAGAGCAGTGGATG-AAGCCAGCCTTTTTTG-3';反義鏈:5'-AATTCAAAAAAGGCTGGCTTCATCCACTGCTCTCTTGAAGCAGTGGATGAAGCCAGCCG-3'。陰性對(duì)照組為上述shRNA編碼序列打亂順序后編碼的產(chǎn)物，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLaST檢索所選序列，不與任何人類、小鼠基因序列同源。對(duì)照組合成的 DNA序列:正義鏈:5'-GATCCGAGCTTGCCTAGCGTCCTCTTCAAGAGAGAGGACGCTAGGCAAGCTCTTTTTTG-3';反義鏈:5'-AATTCAAAAAAGAGCTTGCCTAGCGTCCTCTCTCTTGAAGAGGACGCTAGGCAAGCTCG-3'。各序列均含有59個(gè)寡鏈氨基酸，由大連寶生物科技有限公司合成上述單鏈。將合成好的oligo DNA稀釋到2 μg/ml，放到退火體系中混勻加熱95℃10 min，室溫靜置1 h，將冷卻產(chǎn)物稀釋到 100 倍，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?，7〕。1.2.2 Survivin shRNA重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 由BamH I和EcoR I酶切pBAsi-Hh1載體使其線性化，酶切反應(yīng)體系包括純化的1 μg/μl DNA 質(zhì)粒 2 μl;10 緩沖液 5 μl;100 × BSA 1 μl;10 U/μl的 BamH I 1 μl;10 U/μl的 EcoR I 1 μl;加 H2O至50 μl。將上述混合的反應(yīng)物置于37℃1.5 h，將酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳，隨后切膠;用凝膠純化試劑盒進(jìn)行分離純化。將退火產(chǎn)物雙鏈DNA與酶切線性化處理的pBAsi-Hh1載體片段連接，按質(zhì)粒:目的基因線性片段=1∶5的比例進(jìn)行反應(yīng)，連接體系如下:0.1 μg/μl線性化載體 1 μl，100 ng/μl退火的雙鏈 DNA 1 μl，T4 DNA 連接酶 1 μl，10 × T4 DNA 連接酶緩沖液1 μl，加 dd H2O 至20 μl，于20℃過夜反應(yīng)。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到經(jīng)氯化鈣法制備的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。1.2.3 PCR鑒定及測(cè)序挑選重組陽性克隆行PCR鑒定 挑取8個(gè)菌落克隆抽提質(zhì)粒、擴(kuò)增，抽提的質(zhì)粒經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280，檢測(cè)質(zhì)粒濃度和純度。使用載體多克隆位點(diǎn)兩端的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物序列:5'-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3';下游引物序列為5'-TTATTCCCATGCGACGGTATC-3'，PCR 產(chǎn)物5 μl上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳。挑選陽性克隆送DNA測(cè)序(大連寶生物工程有限公司)。

1.2.4 腺病毒重組體的包裝提取 將腺病毒包裝系統(tǒng)中三種質(zhì)粒DNA，溶于除菌的TE中，用紫外光吸收法測(cè)定其濃度及純度，保證所提取質(zhì)粒DNA的D260/D280在1.8～2.0，用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293ATCC細(xì)胞，向滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pBAsi-Hh1載體20 μg，pBAsi-HU6載體 15 μg，pBAsi-Mu6 載體10 μg)，將 DNA 與 Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至293ATCC細(xì)胞的培養(yǎng)液中，收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞上清液，4℃ 8 000 r/min離心10 min，除去細(xì)胞碎片，0.45 μm PVDF膜過濾，收集病毒置于-80℃低溫冰箱中保存。

2 結(jié)果

2.1 酶切法鑒定Survivin-siRNA重組腺病毒質(zhì)粒 用BamH I和EcoR I雙酶切pBAsi-Hh1載體后線性化，與未經(jīng)酶切載體比較，將線性化載體與DNA oligo連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性重組克隆PCR鑒定，重組克隆PCR片段為59 bp，未插入的空載體PCR片段為78 bp(圖1)，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符，結(jié)果表明合成的survivin shRNA序列插入正確。

圖1 重組載體酶切結(jié)果

2.2 測(cè)序 經(jīng)BamH I和EcoR I酶切產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物送至大連寶生物工程有限公司，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的序列一致。證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖2。

圖2 重組腺病毒質(zhì)粒pBAsi-Survivin測(cè)序結(jié)果

3 討論

Survivin的表達(dá)和分布特異性使其成為腫瘤診斷與治療的新靶點(diǎn)。張文淵等〔8〕檢測(cè)Survivin在宮頸癌中高表達(dá)，且與宮頸癌的臨床分期有關(guān)。Choi等〔9〕發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中Survivin細(xì)胞核表達(dá)83.3%，并與結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Survivin在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，與結(jié)直腸癌的分化和預(yù)后密切相關(guān)。逆轉(zhuǎn)Survivin的表達(dá)能抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

RNA干擾是將靶基因序列同源的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞，與靶基因mRNA結(jié)合，可以特異性阻斷體內(nèi)某些特定基因的表達(dá)，促使靶基因mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因表達(dá)沉默的過程，特異性、穩(wěn)定性、效率性和穿透性均較高，是唯一有可能進(jìn)行長(zhǎng)期基因沉默研究的方法，可直接用于癌癥相關(guān)基因的沉默，以達(dá)到疾病治療或預(yù)防的目的。RNA干擾研究使用的載體大多是質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和脂質(zhì)體等，這些載體攜帶的基因在細(xì)胞核內(nèi)處于游離狀態(tài)，不能整合到染色體上，無法實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)，因而在應(yīng)用上受到一定的限制。而本研究采用的腺病毒載體能整合入宿主染色體，外源基因能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá);宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)小，毒性小;能感染非分裂和分裂期細(xì)胞，具有巨大的應(yīng)用潛力。本研究所采用的腺病毒載體系統(tǒng)由pBAsi-Hh1載體、pBAsi-HU6載體、pBAsi-Mu6載體三質(zhì)粒組成，pBAsi-Hh1載體含有人類H1啟動(dòng)子，使用RNA PolymeraseⅢ類啟動(dòng)子，既可以直接作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞瞬間表達(dá)siRNA，也可以將“啟動(dòng)子hairpin序列”切出后亞克隆至腺病毒載體，利用重組腺病毒載體進(jìn)行siRNA的長(zhǎng)期表達(dá)。而pBAsi-HU6載體，pBAsi-Mu6載體含有病毒包裝所必須的元件。本研究針對(duì)人survivin編碼區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)shRNA，以復(fù)制缺陷型腺病毒作為載體，構(gòu)建了特異性干擾survivin基因的腺病毒載體。與慢病毒載體和反轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，腺病毒載體不轉(zhuǎn)染入染色體，在增殖與非增殖細(xì)胞內(nèi)均可感染，感染效率基本上能達(dá)到100%。經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定證實(shí)病毒載體構(gòu)建成功，經(jīng)包裝產(chǎn)生的腺病毒具有較高滴度，為進(jìn)一步探討 survivin沉默在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中的生物學(xué)行為提供了基礎(chǔ)。

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