王靜波 (解放軍第309醫(yī)院眼科，北京 100091)

肝臟是糖尿病(DM)受累的重要靶器官之一。DM患者由于對(duì)糖的利用障礙，需動(dòng)員大量的脂肪，從而使游離脂肪酸過(guò)多流入肝臟。而游離脂肪酸在肝臟中進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成甘油三酯(TG)，并促進(jìn)極低密度脂蛋白(VLDL)的合成和分泌，從而導(dǎo)致以TG和VLDL升高為主的高脂血癥。syndecan是硫酸肝素蛋白多糖家族成員。脊椎動(dòng)物syndecan家族包括4個(gè)成員，即syndecan-1、-2、-3和-4。syndecan-1是 syndecan家族中研究最多、作用最廣泛的成員，可參與細(xì)胞的分化、黏附和移行，在炎癥、組織損傷和修復(fù)、脂質(zhì)代謝等病理生理過(guò)程中起重要作用〔1〕。筆者既往的研究〔2～4〕表明，syndecan-1 可能參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，但syndecan-1在DM肝臟中的表達(dá)尚不明確。本研究觀察DM大鼠肝臟syndecan-1和信號(hào)通路蛋白激酶C(PKC)的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司，美國(guó))，兔抗鼠syndecan-1多克隆抗體、小鼠抗大鼠PKC多克隆抗體(Santa cruz公司，美國(guó))，枸櫞酸鹽粉劑、磷酸鹽緩沖液(PBS)粉劑、二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒、蘇木素(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)，安穩(wěn)血糖儀及血糖測(cè)試條(長(zhǎng)沙三諾有限公司)，冷凍包埋劑(櫻花，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 36只雄性SD大鼠，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，體質(zhì)量(120±20)g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。大鼠在SPF級(jí)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在25℃左右，濕度約50%。明暗周期12 h，自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，進(jìn)行動(dòng)物造模。造模前，禁食12 h(不禁水)。隨機(jī)選取30只大鼠，STZ 65 mg/kg腹腔注射。對(duì)照組(6只SD大鼠)腹腔注射等量的枸櫞酸鹽溶液。72 h后測(cè)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功。每周監(jiān)測(cè)血糖。30只大鼠中，STZ成功誘導(dǎo)DM大鼠27只(90.0%)，死亡2只(7.4%)。對(duì)照組大鼠體重增加明顯，精神狀況良好，毛皮有光澤，動(dòng)作自如，反應(yīng)靈敏。DM大鼠建模成功后，大鼠出現(xiàn)了典型的“三多一少”癥狀，多飲、多食、多尿，明顯消瘦，精神逐漸萎靡，早期多動(dòng)，后期反應(yīng)遲鈍，動(dòng)作緩慢，毛豎而無(wú)光澤。

1.3 標(biāo)本制備 造模成功后第3、6、9、12、15周(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取5只大鼠)，分別采用過(guò)量氯胺酮麻醉致死，迅速摘除肝臟。切取塊狀肝臟大葉組織，冷凍包埋劑包埋，連續(xù)切出5 μm厚度切片，貼于免疫組化專(zhuān)用防脫載玻片上，晾干后甲醇固定，-80℃冰箱保存。

1.4 免疫組化染色及結(jié)果判讀 冰凍切片用PBS沖洗，3%過(guò)氧化氫溶液室溫10 min，PBS洗;稀釋的syndecan-1抗體(1∶200)或PKC抗體(1∶200)室溫孵育2 h，通用型IgG抗體-辣根過(guò)氧化物酶多聚體37℃ 20 min，PBS洗，DAB顯色，PBS洗;蘇木素復(fù)染，自然水沖洗;梯度酒精及二甲苯脫水，中性樹(shù)膠封片，照相。所有切片由同一個(gè)經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師盲法閱片做出判定，每張切片觀察5個(gè)×400倍視野。以組織切片背景清晰、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)染為淡黃至棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)志。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):不著色為陰性，淡黃色及著色細(xì)胞＜1/3為弱陽(yáng)性，黃色及著色細(xì)胞占1/3～1/2為中度陽(yáng)性，棕褐色著色陽(yáng)性細(xì)胞＞1/2為強(qiáng)陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 肝臟syndecan-1的表達(dá) syndecan-1的表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。在對(duì)照組大鼠，肝細(xì)胞排列整齊，syndecan-1呈陰性表達(dá)。DM 3 w時(shí)，大鼠肝細(xì)胞syndecan-1呈弱陽(yáng)性表達(dá)。6 w時(shí)，肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)小空泡，肝細(xì)胞syndecan-1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);DM 9 w肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)小空泡和15 w時(shí)肝細(xì)胞水腫明顯，肝細(xì)胞syndecan-1的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠肝細(xì)胞syndecan-1的表達(dá)(免疫組化，×400)

2.2 肝臟PKC的表達(dá) PKC的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)。在對(duì)照組大鼠，肝細(xì)胞PKC呈陰性表達(dá)。而在DM大鼠，3 w時(shí)肝細(xì)胞PKC呈弱陽(yáng)性表達(dá);隨著DM病程增加，PKC的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。糖尿病6 w時(shí)肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)小空泡，肝細(xì)胞PKC呈中度陽(yáng)性表達(dá);9 w肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)小空泡和15 w時(shí)，肝細(xì)胞PKC呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

圖2 大鼠肝細(xì)胞PKC的表達(dá)(免疫組化染色×400)

3 討論

2型糖尿病(T2DM)患者肝臟病變的標(biāo)準(zhǔn)死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于心血管并發(fā)癥的標(biāo)準(zhǔn)死亡率。DM肝臟病變包括非酒精性脂肪肝病、肝硬化、肝細(xì)胞性肝癌、慢性肝炎、急性肝功能衰竭，其中最常見(jiàn)的是非酒精性脂肪肝病，其在T2DM患者中發(fā)病率達(dá)50%，在 DM 伴肥胖患者中發(fā)病率近100%〔4，5〕。

既往，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)syndecan-1的研究主要圍繞在該分子在組織損傷修復(fù)和炎癥中的作用。研究〔1〕表明，syndecan-1是介導(dǎo)肝脂質(zhì)代謝的首要蛋白多糖成分，在脂質(zhì)代謝中起重要作用。該分子定位于肝細(xì)胞基底膜的微絨毛上，介導(dǎo)肝細(xì)胞對(duì)乳糜顆粒及 VLDL 殘粒脂蛋白的結(jié)合與攝取〔1，6～9〕。syndecan-1的合成一旦被抑制，肝細(xì)胞對(duì)殘粒脂蛋白的結(jié)合和攝取會(huì)明顯減低〔1，6〕。在syndecan-1基因敲除的小鼠，肝臟細(xì)胞對(duì)TG的清除緩慢，對(duì)VLDL的結(jié)合、攝取和降解減慢〔1，6〕，血中TG含量明顯升高。外源性補(bǔ)充syndecan-1后，TG的代謝恢復(fù)正?！?〕。筆者既往的研究表明，DM患者血清中可溶性syndecan-1的水平與載脂蛋白A1呈負(fù)相關(guān)〔1〕。

研究表明，多數(shù)DM患者血中TG和VLDL明顯升高〔1〕。筆者分析，過(guò)多的脂蛋白會(huì)刺激肝細(xì)胞表達(dá)多量syndecan-1以加速對(duì)脂蛋白的清除。但DM狀態(tài)下，肝細(xì)胞syndecan-1表達(dá)上調(diào)的信號(hào)通路尚不明確。

DM并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，包括非酶糖化作用增強(qiáng)、氧化還原反應(yīng)、醛糖還原酶的激活及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的激活。近年來(lái)，倍受關(guān)注的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是二酯酰甘油(DAG)-PKC的激活。目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物PKC家族至少包括11種異型體(α、β1、β2、γ、δ、ε、ζ、η、θ、λ 及 μ)。DM 狀態(tài)下，持續(xù)的高血糖使細(xì)胞內(nèi)葡萄糖流量增加，葡萄糖代謝所引起的3-磷酸甘油醛生成增加，從而導(dǎo)致DAG合成增加。DAG為PKC的內(nèi)源性激活劑。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)DAG含量增加，可促使PKC移位至細(xì)胞膜而被激活。PKC通路的異常變化可能是高血糖引起的各種紊亂的共同通路〔10〕。PKC的持續(xù)激活可引起細(xì)胞損傷，久之則引起DM慢性并發(fā)癥〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)，早期DM大鼠肝細(xì)胞內(nèi)的PKC即被激活，并隨著糖尿病病程的增加而呈明顯升高趨勢(shì)。筆者推測(cè)并分析，PKC的激活在DM肝病的發(fā)病中起著重要作用。Jung等〔12〕研究表明，PKCδ是通過(guò)對(duì)syndecan-1的調(diào)控而影響細(xì)胞黏附功能。在DM肝病的發(fā)病機(jī)制中，PKC是否可以通過(guò)調(diào)控syndecan-1而影響脂蛋白的代謝尚不清楚。

綜上，在DM肝臟病變中，肝細(xì)胞syndecan-1蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，肝細(xì)胞的PKC通路也被激活。但在DM肝病中，PKC與syndecan-1的相互作用及二者對(duì)肝臟脂蛋白代謝的具體作用及其機(jī)制尚不明確，需通過(guò)更深入的研究進(jìn)一步證實(shí)。

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