左 琪 包 崑 林文秋 徐 鵬 楊霓芝 王榮榮 林綺嵐

(廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 518021)

心血管疾病(CVD)是慢性腎臟病(CKD)最常見(jiàn)的并發(fā)癥和致死原因。國(guó)外學(xué)者報(bào)道3/4腎切除大鼠是研究中期慢性腎衰竭及早期心腎綜合征的好模型〔1，2〕。本課題組擬建立3/4腎切除大鼠并發(fā)早期心腎綜合征模型，擬探索三芪口服液對(duì)該模型心肌病變的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠58只(廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，自由飲水和進(jìn)食1 w以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 藥物與試劑 三芪口服液是廣東省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào):06080709，主要是黃芪、三七等組成，具有益氣活血功效。纈沙坦，血管緊張素受體拮抗劑(ARB類藥物)，北京諾華制藥公司生產(chǎn)。

1.3 模型制備及分組 按大鼠的體重及生長(zhǎng)狀況隨機(jī)分為健康對(duì)照組8只，其余均用3/4腎切除法建立動(dòng)物模型〔1，2〕:以2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉動(dòng)物，俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，大鼠備皮，75%乙醇消毒，從距左肋骨下緣、脊柱旁開(kāi)1.5 cm處皮膚做一縱向切口，長(zhǎng)約1.5 cm，逐層分離筋膜、腹內(nèi)外斜肌筋膜，進(jìn)入后腹膜腔，分離脂肪層，暴露左側(cè)腎臟，鈍性分離脂肪囊，小心剝離腎包膜及腎上腺，注意避免損傷腎上腺，動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎蒂，剪切掉左腎左側(cè)1/2腎實(shí)質(zhì)，明膠海棉壓迫創(chuàng)面止血，去掉動(dòng)脈夾觀察30～50 s后無(wú)繼續(xù)出血，小心將殘腎納入腹腔，逐層縫合肌層、皮下及皮膚，局部消毒。術(shù)后1 w做第2次手術(shù)，同樣方法麻醉，切開(kāi)右背部，暴露右腎，結(jié)扎腎蒂，切除右腎，不要傷及腎上腺。造模成功后將大鼠隨機(jī)分為模型組、三芪口服液組(簡(jiǎn)稱三芪組)、纈沙坦組，每組15只。

1.4 給藥方法 三芪組:1次/3支/kg灌胃，3次/d;纈沙坦組:纈沙坦16 mg·kg-1·d-1用蒸餾水配制成0.16%溶液灌胃;空白組、模型組大鼠灌服等量的生理鹽水。各組治療時(shí)間均為15 w;所有大鼠飼養(yǎng)條件:室溫24℃，12 h光照，12 h黑暗，充足水供和飼料，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 血樣的采集和生化指標(biāo)測(cè)定 0.17%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉，眼球靜脈叢取血，使用無(wú)抗凝管(保留血清)，凍存于-80℃冰箱中待測(cè)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及第16周，使用全自動(dòng)生化分析檢測(cè)血清肌酐(Scr)水平。

1.6 心臟重量參數(shù)測(cè)定 第16周末，用100 g/L的水合氯醛行腹腔注射，麻醉后開(kāi)胸取出心臟，迅速置于4℃預(yù)冷生理鹽水中沖洗血污，濾紙吸干稱質(zhì)量，沿房室交界處去除心房和大血管，去除右心室游離壁，分離左心室，并分別準(zhǔn)確稱全心重(Hw)及左心室重量(LVw)，根據(jù)體重(Bw)，計(jì)算心臟重量指數(shù):LVw/Hw，Hw/Bw，評(píng)判左心室重構(gòu)程度。

1.7 心肌蘇木素-伊紅(HE)、Masson染色和組織病理學(xué)分析從左心室切取3 cm×3 cm×3 cm心肌組織，置10倍量4%中性甲醛固定。石蠟包埋，切片，切片厚度4 μm，行HE染色Laica顯微鏡拍照。心肌冠狀溝下約1 mm處，橫切心肌標(biāo)本，固定，脫水、透明、石蠟包埋，切片行Masson染色;根據(jù)Masson染色結(jié)果采用HPIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照和分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組Scr水平比較 自身前后比較，模型組、三芪組、纈沙坦組較實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)明顯升高(P＜0.01)，空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示造模成功。組間兩兩比較，各組Scr在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);16 w后，模型組、三芪組及纈沙坦組均較空白組明顯升高(P＜0.01);16 w后，三芪組、纈沙坦組與模型組比較，Scr明顯降低(P＜0.05);三芪與纈沙坦組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血肌酐水平(s，n=15，μmol/L)

表1 各組血肌酐水平(s，n=15，μmol/L)

與空白組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

0 w 39.1 ±4.79 39.3 ±4.77 38.6 ±4.89 39.6 ±4.82 16 w 39.70 ±4.92 67.67 ±4.951)58.67 ±7.681)2)58.82 ±7.111)2)

2.2 心臟重量參數(shù)測(cè)定 模型組LVw/Hw、LVw/Bw、Hw/Bw較空白組、三芪組及纈沙坦組均明顯升高(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05);三芪組LVw/Hw、LVw/Bw較模型組明顯減低(P＜0.01，P＜0.05)，與空白組、纈沙坦組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);三芪組Hw/Bw與其他三組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。纈沙坦組 LVw/Hw、LVw/Bw、Hw/Bw 較模型組明顯減低(P ＜0.01，P ＜0.05，P ＜ 0.05)，但與三芪組、空白組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 HE染色 與空白組對(duì)比，模型組出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大，模型組心肌細(xì)胞變粗，排列不均勻。三芪組、纈沙坦組與模型組比較，心肌細(xì)胞肥大及排列不均勻明顯改善。見(jiàn)圖1。

2.4 Masson染色，正常組的心肌細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞外基質(zhì)少而不明顯。與正常組相比，模型組相同切片做Masson染色后，纖維排列疏松、紊亂，間質(zhì)有藍(lán)色膠原沉積。三芪組、纈沙坦組未見(jiàn)明顯心肌間質(zhì)膠原沉積，纖維排列疏松、紊亂有所改善。見(jiàn)圖2。

表2 心臟重量參數(shù)測(cè)定( s，n=15)

表2 心臟重量參數(shù)測(cè)定( s，n=15)

模型組與其他三組之間比較:1)P ＜0.01，2)P ＜0.05，與模型組之間比較:3)P ＜0.01，4)P ＜0.05

組別 Hw(g)LVw(g)BW(kg)LVw/Hw(g/g)LVw/Bw(g/kg)Hw/Bw(g/kg)687 ±0.078模型組 1.070 0.796 0.420 0.744 ±0.0921) 1.894 ±0.0702) 1.894 ±0.0702)三芪組 0.965 0.693 0.396 0.719 ±0.0913) 1.756 ±0.1094) 1.756 ±0.109纈沙坦組 1.001 0.712 0.415 0.710 ±0.0143) 1.712 ±0.0854) 1.712 ±0.0855)空白組 0.979 0.686 0.407 0.709 ±0.021 1.687 ±0.078 1.

圖1 各組心肌HE染色(×200)

圖2 各組心肌Masson染色(×200)

3 討論

CVD是CKD最常見(jiàn)的并發(fā)癥和致死原因。2007年國(guó)際腎臟病學(xué)會(huì)指出我國(guó)CKD累及人口約有1億，尿毒癥約100萬(wàn)，且以每年8%～11%的速度遞增，CVD所致死亡占終末期腎病總病死率的45% ～50%〔1〕。侯凡凡等〔2〕對(duì)全國(guó)CKD患者CVD患病率調(diào)查顯示，左心室肥厚58.5%，冠心病16.5%，慢性心力衰竭27.7%。上海瑞金醫(yī)院調(diào)查顯示CKD 1～5期患者CVD患病率分別為 5.13%、17.24%、27.86%、26.92%、47.49%，提示CVD在CKD 1期即已出現(xiàn)，且隨CKD的進(jìn)展其患病率逐漸提高。Ronco等〔3〕根據(jù)CRS不同的臨床表現(xiàn)、病理生理學(xué)和診療等提出將CRS分為5個(gè)亞型。其發(fā)病機(jī)制主要有:腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活、一氧化氮-活性氧(NOROS)平衡、交感神經(jīng)的過(guò)度激活和炎癥反應(yīng)等〔4〕。

CKD與糖尿病、高血壓和CVD存在著復(fù)雜的相互關(guān)系〔5〕。研究表明，CKD患者血壓水平與病死率呈U型關(guān)系，即過(guò)高或過(guò)低的血壓都將增加其心腦血管事件的發(fā)生率和病死率，因此在控制血壓時(shí)應(yīng)避免使收縮壓過(guò)度降低;糾正腎性貧血糾正鈣磷代謝紊亂及繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)糾正血脂紊亂、高Hcy血癥、胰島素抵抗，補(bǔ)充L-肉堿等其他措施。

國(guó)外學(xué)者報(bào)道3/4腎切除大鼠是研究中期慢性腎衰竭及早期心腎綜合征的好模型〔6，7〕，為研究中期CKD并發(fā)CVD提供了良好的基礎(chǔ)。

《吳醫(yī)匯講·卷八》提示心腎息息相關(guān)，腎臟受損，必然導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)、氣化不通，水火不濟(jì)，精血無(wú)力化生等等。另外，腎病早中期多為氣虛(脾腎)，水濕無(wú)力運(yùn)化、氣化，致水濕瘀阻，泛濫肌膚、血行瘀滯，久之心氣受損，至晚期水氣凌心，癥見(jiàn)水腫明顯，心悸、喘促等。由此可知，腎臟虧損為腎心病變的基礎(chǔ)，而氣虛血淤則是貫穿疾病發(fā)生發(fā)展的重要病機(jī)。

黃芪和三七分別是益氣健脾法和活血化瘀法的代表中藥，二藥配伍是益氣活血法的代表?！睹t(yī)別錄》認(rèn)為黃芪“無(wú)毒，逐五臟問(wèn)惡血，補(bǔ)丈夫虛損，五勞贏瘦，腹痛泄利，益氣，利陰氣”，即黃芪兼具益氣健脾、活血化瘀的功效;三七，又名田七，《藥性蒙求》記載“三七，味甘苦同人參，故人并稱日參三七，去疲損，止吐衄，補(bǔ)而不峻”，即三七具有活血、補(bǔ)血、健益脾胃之效。由黃芪和三七配伍為主制成為三芪口服液十余年來(lái)廣泛用于治療CKD，收效頗豐。三芪口服液由黃芪、三七等組成，既往研究提示，三芪口服液可抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖及LPS誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞白細(xì)胞介素(IL)-1β的產(chǎn)生〔8〕;減輕5/6腎切除大鼠腎臟病理?yè)p害，明顯降低腎臟細(xì)胞凋亡率〔9〕;改善氣虛血淤證單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管間質(zhì)纖維化〔10〕。

本研究結(jié)果提示，3/4腎切除大鼠模型在第16周時(shí)，造模成功，左心室出現(xiàn)明顯的心肌重構(gòu)。心肌HE、Masson染色方面提示三芪口服液能改善心肌纖維化。

綜上，3/4腎切除大鼠模型是早期心腎綜合征的良好模型，益氣活血中成藥三芪口服液可降低模型大鼠Scr水平，改善腎功能，并且能降低LVw/Hw、Lvw/Bw指數(shù)，改善左心室重構(gòu)及心肌纖維化，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用，進(jìn)一步可從分子生物學(xué)水平深入研究其作用機(jī)制。

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