張 偉 任鳳云 金 丹 潘艷明 胡 靜 馮玉寬 王加良

(牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

目前，非小細胞肺癌(NSCLC)是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤，已成為腫瘤患者死亡的首要病因〔1〕。臨床研究表明，NSCLC患者早期即可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，確切檢測患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對于優(yōu)化治療方案和正確評估患者預后具有重要意義，這也使評估淋巴轉(zhuǎn)移的分子標志物的確定研究顯得尤為重要〔2～4〕。血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)屬于 VEGF家族成員，是目前發(fā)現(xiàn)的特異性淋巴管生成因子。本實驗研究下調(diào)VEGF-C基因表達對NSCLC細胞株增殖和侵襲能力的影響，為進一步明確VEGF-C在NSCLC中表達的作用和成為抗腫瘤治療策略的可行性提供基礎實驗資料。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑 人NSCLC細胞系A549購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，細胞起源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)，用含10%小牛血清(FBS)的 RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(美國 Invitrogen公司)。PSIH1-H1-copGFP shRNA Vector及慢病毒載體系統(tǒng)為美國System Biosciences公司產(chǎn)品;TRIzol試劑、內(nèi)切酶 EcoRⅠ、BamHⅠ、T4連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及感受態(tài)細胞購于大連TaKaRa公司;抗VEGF-C抗體及二抗購于美國Snata Cruz公司，蛋白提取試劑、蛋白定量試劑盒及增強化學發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒購于美國Pierce公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于美國Millipore公司;細胞侵襲試劑盒QCMTH24-well Fluorimetric Cell Invasion Assay kit)均購于美國Chemicon公司。

1.2 構(gòu)建靶向VEGF-C基因的干擾質(zhì)粒pSIH1-H1-copGFPVEGF-C 根據(jù)VEGF-C(NM005429)mRNA序列信息，使用siRNA Target Finder在線siRNA序列設計軟件，設計針對其CDS區(qū)的 siRNA序列:5'-CCTCAGCAAGACGTTATTT-3'，根據(jù)siRNA序列，設計兩條互補的DNA模板單鏈，模板鏈包括siRNA的正義鏈和反義鏈，中間以12個脫氧核苷酸的Loop結(jié)構(gòu)(5’-CTTCCTGTCAGA-3’)相連，后面接有 RNA PolyⅢ聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點(TTTTT)，同時模板鏈兩端分別添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，退火形成互補雙鏈DNA。pSIH1-H1-copGFP shRNA質(zhì)粒雙酶切后與上述退火產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細菌，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種LB培養(yǎng)基，37℃、300 r/min搖床培養(yǎng) 16 h，提取 pSIH1-H1-copGFPVEGF-C質(zhì)粒，測序并進行序列分析。

1.3 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C的包裝和生產(chǎn) 使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)293TN細胞(System Biosciences，Cat.#LV900A-1)，0.6 ml胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞接種至10 cm貼壁細胞培養(yǎng)皿上，每皿接種數(shù)目為1.5×106個，接種24 h后，細胞貼壁密度約為85%，細胞梭型，中央發(fā)亮，形態(tài)飽滿，適合轉(zhuǎn)染實驗。使用LipofectmaineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒用量為 Lentivirus Package plasmids mix(500 ng/μl)，22 μl;Lv-VEGF-C siRNA plasmid DNA(500 ng/μl)，4 μl;轉(zhuǎn)染試劑用量每 10 cm 培養(yǎng)皿為 40 μl。轉(zhuǎn)染后48 h，鏡下觀察細胞液發(fā)黃，貼壁細胞密度約為90%，細胞扁平，貼壁狀態(tài)較好。收集細胞上清，5 000 r/min離心5 min，去掉細胞碎片沉淀，然后使用0.45 μm的 PVDF膜過濾上清液，冰浴條件下過夜保存;梯度稀釋法進行重組慢病毒滴度測定，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.8，實驗室配制)將病毒顆粒濃度調(diào)整至1×104ifu/μl，按1 ml每管濃度調(diào)整后的病毒液進行分裝，-70℃保存待用。所收集的病毒分別命名為Lv-siRNA-VEGF-C組和Lv-Ctrl(空載質(zhì)粒組)。

1.4 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染A549細胞 接種處于對數(shù)生成長期的A549細胞到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔1.0×104個細胞，分別加入 100、50、40、30、20、10 μl標準 copGFP 標記的病毒液(1×104ifu/μl)感染A549細胞，換液后72 h，熒光倒置顯微鏡下觀察，綠色熒光表達比較穩(wěn)定，使用胰酶消化的方法對細胞進行計數(shù)，進行數(shù)據(jù)分析，確定細胞感染效率達到100%時最少病毒用量，計算最佳感染復數(shù)(MOI)值。按照MOI添加病毒液，同時設Lv-Ctrl組和未轉(zhuǎn)染組，37℃和5%CO2的條件下，正常培養(yǎng)。放大培養(yǎng)細胞克隆，挑取最穩(wěn)定的克隆，進行傳代培養(yǎng)，并且收集不同代數(shù)的細胞，提取total RNA和總蛋白，進行Real-Time RT-PCR和Western印跡檢測。

1.5 Western印跡法檢測細胞VEGF-C蛋白的表達 分別收集Lv-siRNA-VEGF-C細胞和對照組細胞1.5×106個，加入4℃預冷的蛋白裂解液充分裂解，4℃條件下12 000 r/min離心15 min，收集上清使用二喹啉甲酸(BCA)法進行總蛋白濃度檢測。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，常溫封閉2 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)沖洗2遍，加入VEGF-C一抗(1∶200)，4℃ 過夜，TBST緩沖液洗膜 3次，10 min/次，加入二抗(1∶3 000)，室溫反應1 h;TBST洗膜3次，10 min/次。加入Pierce?ECL試劑，曝光3 min，顯影后清水漂洗、再定影。采用灰度掃描軟件TotalLab進行膠片掃描，分析檢測結(jié)果。

1.6 噻唑藍(MTT)法檢測VEGF-C基因沉默對A549細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細胞，使用胰酶消化方法制備細胞懸液，細胞濃度為5×104個/ml接種細胞到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔添加細胞懸液100 ml。細胞接種后12 h，細胞全部貼壁，對細胞進行換液處理，使用添加10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，并作為MTT檢測零點，置37℃、5%CO2、飽和濕度條件培養(yǎng);加入濃度為 5 mg/ml的 MTT(M2128，sigma)，15 μl/孔，37℃、5%CO2、飽和濕度條件孵育4 h。樣品處理按照以下時間點進行:0、24、48、72 h;棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl/孔，振蕩約10 min;MultiSkan FC酶標儀(G49D1BB9D0ADE5，Thermo)測A值，波長為570 nm，參照波長630 nm。

1.7 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力 復蘇液氮凍存的A549細胞、Lv-Con-A549及Lv-siRNA-VEGFC-A549細胞，使用不含血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度至5×105個/ml，將培養(yǎng)板和試劑置于室溫，使其溫度平衡至室溫，使用70%乙醇對插入小室進行消毒處理;取細胞懸液300 μl加入小室，下室中加入500 μl添加含血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵箱中孵育4 h;切取膜，進行Giemsa染色，染色后將膜鋪在蓋玻片上進行拍照;每個樣本的平行樣，把侵襲小室放到一個含有225 μl預溫的細胞脫落試劑的孔中，37℃孵育30 min;使細胞徹底脫落，準備充足的裂解緩沖液/染色試劑，用4倍裂解緩沖液以1∶75稀釋CyQuant GR染料(如4 μl染料加入4X裂解緩沖液)，向已含有225 μl細胞脫落試劑及侵襲透過膜的細胞的孔中加入75 μl稀釋后的裂解液，室溫孵育15 min;吸取200 μl上述混合液至96孔板中，用于熒光檢測;使用熒光分光光度計進行熒光檢測，檢測條件:激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為520 nm。

1.8 慢病毒途徑VEGF-C-RNAi腫瘤的基因治療實驗 裸鼠15只(由第二軍醫(yī)大學動物實驗中心提供)，體重18～20 g;雌雄各半;將裸鼠編號、稱重后，分為對照組(blank)，空載體對照組(Lv-Con)，實驗組(Lv-siRNA-VEGF-C)。取處于對數(shù)生長期的A549細胞，使用胰酶消化的方法收集細胞，使用胎牛血清重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至107個/ml的胎牛血清懸液，每只小鼠于左前肢腋下皮下注射0.1 ml。接種后15 d可觀察到皮下腫瘤形成，從接種后第15天開始，按時間點多次給藥，每24 h進行尾靜脈注射，每次注射量為250 ml，給藥3 w。于最后一次給藥后24 h，先對小鼠稱重，然后以頸椎離斷法處死全部小鼠。處死后分離腫瘤并稱重和測量體積。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料用s表示，采用t檢驗和One-Way ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C成功感染A549細胞 插入片段與設計的VEGF-C shRNA核苷酸序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)有突變、缺失、插入等異常存在，表明已經(jīng)成功構(gòu)建靶向VEGFC基因的重組慢病毒載體Lv-siRNA-VEGF-C。將重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染A549細胞，慢病毒 Lv-siRNA-VEGF-C感染A549細胞的效率達90%。見圖1。

2.2 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染下調(diào)A549細胞中VEGF-C蛋白的表達 慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染后A549細胞中VEGF-C蛋白的表達量明顯降低，與Lv-Ctrl感染組和未感染組A549細胞相比，慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染后A549細胞中VEGF-C蛋白的表達水平明顯降低〔(0.23±0.02)vs(0.54 ±0.03)、(0.56 ±0.01)，P ＜0.01〕。因此，所構(gòu)建的慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C可有效沉默A549細胞中VEGF-C蛋白的表達。見圖2。

圖1 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染A549細胞(×200)

圖2 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染抑制A549細胞中VEGF-C蛋白的表達

2.3 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染抑制A549細胞的增殖 感染48 h，Lv-siRNA-VEGF-C感染組A549細胞增殖活性明顯低于未感染組(0.19 ±0.09)vs(0.34 ±0.05)，P ＜0.05〕。感染72 h后，Lv-siRNA-VEGF-C感染組A549細胞增殖明顯低于未感染組〔(0.258 ± 0.02)vs(0.46 ± 0.07)，P ＜0.01〕。因此，重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染A549沉默VEGF-C基因的表達可抑制細胞的增殖。

2.4 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染抑制A549細胞的定向遷移和侵襲能力 Lv-siRNA-VEGF-C組的細胞侵襲能力明顯下降，其 RFU值較未感染細胞 A549和 Lv-Con下降了30.85%和 30.80%(P ＜0.001)。見圖 3。

圖3 重組慢病毒Lv-siRNA-VEGF-C感染抑制A549細胞的增殖(×200)

2.5 VEGF-C基因的干預對裸鼠移植瘤的成瘤影響 空白對照組腫瘤的平均重量明顯高于Lv-siRNA-VEGF-C治療組(1 050.6 ±180.70)vs(592.8 ± 132.81)mg，P=0.006)，空白對照組腫瘤的平均腫瘤體積亦明顯高于治療組〔(227.86±22.73)vs(92.46 ±11.08)mm3，P ＜0.001)。

3 討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是決定人類腫瘤惡性表型的關(guān)鍵因素，也是導致腫瘤患者死亡的主要原因〔5〕，是通過表達某一生長因子及其特異受體而組成其自身的自分泌信號通路來獲得侵襲和遷移能力〔6〕。有研究顯示許多生長因子及其受體參與腫瘤的侵犯和轉(zhuǎn)移過程〔7〕，包括VEGF-C/VEGFR-3淋巴管生長信號軸〔8〕，如何中斷這些生長因子及其受體組成的信號通路，進而抑制腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，目前已經(jīng)成為研發(fā)抗癌新藥物的主要策略之一。

VEGF-C在腫瘤細胞表達是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞穿過細胞外基質(zhì)(ECM)是一關(guān)鍵步驟。侵襲通過ECMatrix的細胞用相對熒光值(RFU)來表示，RFU值是用CyQuant染料檢測到的，這種染料可與細胞核結(jié)合而激發(fā)出很強的熒光。本研究結(jié)果表明，VEGF-C在NSCLC的表達是影響腫瘤細胞侵襲能力的因素，VEGF-C RNA干擾的作用足以阻止細胞侵襲通過基質(zhì)膜。

以往的研究大多集中于VEGF-C對血管和淋巴管生成作用的研究〔9〕，很少有研究顯示其對腫瘤細胞的增殖有作用。本研究VEGF-CsiRNA對NSCLC裸鼠移植瘤模型的治療作用進行了體內(nèi)試驗研究，結(jié)果顯示經(jīng)慢病毒介導的VEGF-C基因的RNA干擾治療后，腫瘤的體積和重量明顯減小，研究過程中，直至實驗結(jié)束，實驗動物在注射病毒液后未出現(xiàn)中毒、異常行為、體重減少等不良反應。

綜上，VEGF-C的表達對NSCLC A549細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移起著重要作用;由VEGF-C介導的促進腫瘤細胞增殖和侵襲是影響NSCLC增殖和侵襲的重要因素，而有關(guān)其下游信號通路的研究將豐富這方面的信息，以VEGF-C靶點，沉默其表達的方法有望成為NSCLC治療的新策略，這方面仍需要大量的基礎和臨床研究。

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