彭淑瑩，伍臘妍 (.肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)技藥學(xué)系檢驗(yàn)教研室，廣東 肇慶 56000;:廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 肇慶 56000)

急性白血病(AL)是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，病程短，死亡率高，嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康?，F(xiàn)代治療之后有不少患者病情獲得緩解以至于長期存活，但傳統(tǒng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)法檢查已經(jīng)無法滿足現(xiàn)在臨床治療的要求［1］。隨著流式細(xì)胞儀和FISH技術(shù)的發(fā)明，其在血液病診斷和治療中的應(yīng)用越來越廣泛。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用FISH技術(shù)聯(lián)合流式細(xì)胞儀免疫分型可以在細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)檢查的基礎(chǔ)上將急性白血病診斷率提高到90% ～99%，且對臨床個體化治療和判斷預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。我校檢驗(yàn)教研室聯(lián)合人民醫(yī)院分別應(yīng)用上述兩種方法對來診的76例急性白血病患者進(jìn)行初診，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2011年7月～2013年7月到人民醫(yī)院血液科就診的76例急性白血病患者為研究對象，男女比例為2∶1，平均年齡39.3歲。經(jīng)過最終確診，急性髓細(xì)胞白血病(AML)54例，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)22例。

1.2 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查方法:按照常規(guī)骨髓穿刺、涂片和染色，細(xì)胞化學(xué)檢查，油鏡下分類計(jì)數(shù)300個細(xì)胞，按FAB標(biāo)準(zhǔn)對AL進(jìn)行分型。

1.3 流式細(xì)胞儀免疫分型

1.3.1 儀器與試劑:FACScalibur型流式細(xì)胞儀。單抗包括CD 3、CD 5、CD 7、CD 10、CD 13、CD 14、CD 19、CD 20、CD 22、CD 33、CD 34、CD61、CD117、MPO、HLA-DR 等，流式細(xì)胞儀及所有單抗均購自當(dāng)?shù)亟?jīng)銷商。

1.3.2 方法:每管培養(yǎng)液中加入經(jīng)肝素抗凝處理的骨髓液50 μl和3種熒光標(biāo)記抗體各20 μl，溫室孵育30 min，再加入2 ml紅細(xì)胞溶解液。搖勻后溫室放置10 min，PBS洗滌一次并加入1 ml PBS待檢。用流式細(xì)胞儀測定前，以標(biāo)準(zhǔn)校正熒光微球校正。

1.4 FISH技術(shù)

1.4.1 儀器與試劑:ThermoBrite原位雜交儀、尼康熒光顯微鏡。探針為 BCR-ABL、TEL-AML、PML-RARa、AML1-ETO。購于當(dāng)?shù)蒯t(yī)療器械供應(yīng)商。

1.4.2 方法:流式細(xì)胞儀免疫分型還不能準(zhǔn)確分型的患者，采用FISH技術(shù)進(jìn)行染色體異常檢查。取處理過的骨髓液進(jìn)行固定和預(yù)處理，配制雜交液。在雜交前，將探針加入雜交液中，滴在處理過的骨髓細(xì)胞上進(jìn)行雜交。雜交完成后用SSC進(jìn)行脫洗，在熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查:細(xì)胞形態(tài)學(xué)正確診斷的AL患者有49例，其中MO-M7型分別為1例、7例、10例、6例、4例、2例、1例、1例，ALL1-ALL3型分別為8例、6例、3例。診斷率為64.47%。

2.2 流式細(xì)胞儀免疫分型:經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測診斷的AL患者有67例，其中AML45例，ALL22例，診斷率為88.16%。8例形態(tài)學(xué)誤診為AML患者經(jīng)流式細(xì)胞儀免疫分型檢測分別確診為B-ALL(5)、T-ALL(3例)，而9例誤診為ALL的患者分別被確診為 M1(1例)、M3(4例)、M5(3例)、BAL(1例)。結(jié)果見表1。

2.3 FISH技術(shù):剩余的9例患者經(jīng)過FISH檢測，發(fā)現(xiàn)5例存在染色體異常，其中t(9;22)1例，t(15;17)1例，t(8;21)1例，t(12;21)2例。聯(lián)合流式免疫分型總診斷率為94.73%。

表1 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測的AL各亞型表型分類

3 討論

骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)檢測主要以形態(tài)學(xué)為依據(jù)，是早期白血病檢測的主要手段，但由于白血病細(xì)胞具有異質(zhì)性，在AL的診斷中鑒別ALL和AML具有一定困難。因此，2008年世界衛(wèi)生組織規(guī)定白血病的準(zhǔn)斷必須聯(lián)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)的試驗(yàn)室診斷、臨床癥狀和體征［2］。其中，免疫學(xué)診斷主要依靠的是流式細(xì)胞儀免疫分型，它是基于細(xì)胞表面固有標(biāo)志物的一種檢查，既客觀又有很好的重復(fù)性，在歐美發(fā)達(dá)國家已經(jīng)成為臨床白血病診斷與療效監(jiān)測不可缺少的依據(jù)［3-4］。當(dāng)然這種方法不是萬能的，有些白血病并不能通過流式免疫分型來明確診斷，上述試驗(yàn)結(jié)果也說明這一點(diǎn)。

在流式免疫分型檢測也不能明確診斷時，應(yīng)采取進(jìn)一步明確診斷的方法，如FISH。FISH是另一種白血病分型技術(shù)，它利用熒光標(biāo)記單鏈DNA探針與涂片上白血病骨髓細(xì)胞中的互補(bǔ)DNA進(jìn)行雜交，然后在熒光顯微鏡下觀察，對染色體異常進(jìn)行診斷。FISH檢測價格昂貴，這在臨床應(yīng)用時受到諸多限制。它并不能代替流式免疫分型，但聯(lián)合應(yīng)用可使流式免疫分型更為準(zhǔn)確和深入，尤其是多色熒光原位雜交技術(shù)(M-FISH)的發(fā)展。因此，F(xiàn)ISH是對流式免疫分型的有益補(bǔ)充［5］。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ISH聯(lián)合流式免疫分型確診率為94.73%，這一結(jié)果優(yōu)于骨髓形態(tài)學(xué)檢查(64.47%)和單用流式免疫分型(88.16%)。

綜上所述，聯(lián)合應(yīng)用FISH和流式免疫分型不但可以大大提高AL診斷的正確率，而且可以明確異常細(xì)胞的譜系來源，分辨染色體核型異常。同時，對于AL的靶向治療和判斷預(yù)后有重要意義。

［1］ 宋國昀.血像、骨髓像形態(tài)學(xué)改變對兒童白血病診斷分型的意義［J］. 吉林醫(yī)學(xué)，2009，30(15):1594.

［2］ Steven HS，Elias C，Nancy LH，et al.WHO Classofocation of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues［J］.4th edition，2008，WHO Press，WHO:14.

［3］ Peters JM，Ansari MQ.Multiparameter flow cytometry in the diagnosis And management of acute leukemia［J］.Arch Pathol Lab Med，2011，135(1):44.

［4］ Okada Y.Flow cytometry--the basis of cell surface analysis and clinical application［J］.Rinsho Byori，2010，58(11):1121.

［5］ Kearney L.M-FISH:technique，developments and applications［J］.Cytoge-nengt Genome Res，2006，114(3-4):189.